分枝杆菌利福平耐药基因rpoB高通量突变文库的构建

【目的】建立利福平耐药基因rpoB高通量突变文库。【方法】通过同源重组和L5 attB噬菌体整合位点交换构建耻垢分枝杆菌ΔrpoB attB::rpoB菌株;基于L5 attB质粒交换系统和抗性选择培养基,挑取48个克隆以验证质粒替换的效率;针对利福平耐药决定区(RRDR)区域内以每3个碱基为单位设计简并性引物,通过PCR扩增获得该区域81个碱基的全覆盖式突变文库;文库片段与载体进行无缝克隆转化到大肠杆菌中形成大肠杆菌突变文库;基于质粒交换原理,将突变质粒库转化至耻垢分枝杆菌ΔrpoB attB::rpoB菌株中,替换原有L5 attB位点质粒,形成耻垢分枝杆菌突变文库;通过基因组提取、建库和高通量测序明确文库的基因型种类。【结果】与野生型rpoB基因(5600 bp)相比,敲除株的扩增片段为2200 bp,证明耻垢分枝杆菌ΔrpoB attB::rpoB条件性敲除株构建成功;质粒替换的成功率为100%;大肠杆菌文库和耻垢分枝杆菌文库中单氨基酸突变类型均为540种,大肠杆菌文库多点突变5301种,耻垢分枝杆菌文库多点突变853种,大肠杆菌文库和耻垢分枝杆菌文库相关系数为0.84。【结论】开发了一种针对分枝杆菌必需基因rpoB突变体文库的构建策略,成功建立了利福平耐药基因rpoB的突变文库。

MCR-1介导多黏菌素耐药性的分子机制研究进展

多黏菌素耐药基因mcr-1的出现为临床感染治疗带来了新的挑战。自其发现以来,已有6大洲61个不同的国家或地区报道了mcr-1的流行。为了遏制mcr-1的流行,我国农业农村部颁布了禁用多黏菌素作为饲料添加剂的禁令。尽管已有研究指出停用多黏菌素作为动物饲料添加剂可有效降低动物源、环境源和人源样本中mcr-1阳性菌的检出率,但是mcr-1在临床上仍呈低流行性的状态。截至目前已经发现34种mcr-1突变体和9种不同的MCR家族蛋白,未来是否会进化出流行率更高的MCR亚型也有待观察。关于mcr-1介导多黏菌素耐药的分子机制及其影响细菌细胞壁的机制也有新的成果不断出现。本文将对mcr-1的流行性、耐药机制及其对细菌适应性影响的分子机制3个方面的最新进展进行简要综述,以期为遏制多黏菌素耐药基因mcr-1的传播提供可参考依据。

规模化猪场大肠杆菌β-内酰胺类药物耐药性检测及其超广谱β-内酰胺酶调查

为阐明我国规模化猪场大肠杆菌(E.coli)对抗菌药物的耐药现状和耐药机制,本研究于2006年2月至2008年12月从19个省市97个规模化猪场分离鉴定602株E.coli,进行了4大类16种抗菌药物耐药性检测和产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)菌株的筛选,采用PCR方法检测了9种常见β-内酰胺酶耐药基因,对产ESLBs菌株进行了脉冲电场凝胶电泳(PFGE)分析。结果显示:E.coli分离株对抗菌药物产生了不同程度的耐药性,602株E.coli中共有57株产ESBLs,产ESBLs菌株普遍耐受第二及第三代头孢药物。分别有35株和20株E.coli为blaCTX-M型和blaSHV型ESBLs,尚未发现blaOXA型和blaKPC型。PFGE结果显示,产ESBLs菌株间同源性低,推测我国猪源E.coli产ESBLs多为零星发生或以质粒介导的形式传播。本研究为了解我国猪源E.coli对β-内酰胺类药物的耐药现状和ESBLs变化趋势提供了实验依据。

大肠杆菌β-内酰胺酶耐药基因bla_(TEM),bla_(SHV),bla_(CTX-M)三重PCR检测方法建立

本研究以我国大肠杆菌中常见的3种β-内酰胺酶耐药基因(bla,TEMblaSHV和blaCTX-M)作为目的基因,设计3对特异性引物,建立了blaTEM,blaSHV和blaCTX-M耐药基因三重PCR检测方法。三重PCR反应体系为:10×PCR缓冲液2.5μL,MgCl2(25mmol/L)2.5μL,dNTP(2.5mmol/L)4μL,blaTEM,blaSHV和blaCTX-M上下游引物(25μmol/L)分别为0.25μL、0.5μL、1.0μL,Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)0.4μL,模板2.5μL,反应总体积为25μL。反应参数为:94℃5min,94℃50s,55℃55s,72℃1min,32个循环,72℃延伸5min。本方法的建立为大肠杆菌中β-内酰胺酶耐药基因的快速检测及分子流行病学调查提供了新的手段。

注重三个强化

抓学习教育——强化贯彻条例的自觉性。团党委在组织官兵学习贯彻预防犯罪工作条例中，突出抓了读、讲、议三个环节，有效增强了官兵自觉贯彻条例的意识。一是组织官兵读。采取原原本本通读、精选章节诵读、重点内容解读等方法，组织官兵逐字逐句反复阅读《条例》，对重点内容逐条讲解诠释，让官兵既清楚“禁止行为有哪些”，又明白“具体原因是什么”。

思想政治工作创新发展的新思路

新时期新阶段，思想政治工作的环境、任务、对象等都发生了许多深刻和全面的变化，部队思想政治工作如何适应新的形势和任务的需要不断创新发展，这是摆在我们面前、需要不断探索解决的问题。任何事物的发展都离不开具体的客观环境，离不开满足某种社会历史的客观需求。

加强基层党支部能力建设的路径

一、抓住关键，不断提高正副书记的五种能力 支部行不行，关键前两名。正副书记在支部能力建设中具有关键作用，必须努力提高以下五种能力：一是把握大局的能力。正副书记要自觉从全局的角度考虑问题，坚持把思想政治建设摆在首位，确保部队的高度集中统一：牢固树立抓训练就是抓中心抓主业的思想，采取有效举措提高整体训练水平；

甲胎蛋白检测在HBV感染相关疾病中的临床意义

目的:探讨甲胎蛋白(AFP)检测在HBV感染相关疾病中的临床意义和作用。方法:检测慢性乙型肝炎(慢乙肝)合并肝癌(290人)、慢乙肝合并肝硬化(333人)、慢乙肝(361人)、无症状HBV携带(113人)及正常健康者(240人)血AFP水平,用Lo-gistic回归方法分析影响AFP升高的因素,用Spearmen等级相关方法分析AFP升高幅度与疾病严重程度的相关性。结果:五个观察组中,AFP>20ng/mL的阳性率分别为70.7%、44.4%、16.3%、2.7%和0%;AFP>200ng/mL阳性率分别为46.6%、9.3%、1.7%、0.9%和0%;AFP>400ng/mL阳性率分别为37.4%、4.8%、0.8%、0%和0%;AFP>1000ng/mL阳性率分别为26.6%、1.5%、0.6%、0%和0%。回归分析结果提示慢乙肝、饮酒量、饮酒年数、年龄及ALT和AST与AFP>20ng/mL相关;慢乙肝与AFP>200ng/mL相关;AST与AFP>400ng/mL相关;总胆红素及直接胆红素与AFP>1000ng/mL相关。等级相关分析结果发现AFP升高幅度与疾病的严重程度有相关性(r=0.533,P<0.01)。结论:AFP升高在不同HBV感染相关疾病组的临床意义有所不同;慢乙肝、饮酒、年龄及肝功能等因素可影响AFP的水平;AFP>400ng/mL高度提示肝癌的发生。

规模化猪场繁殖障碍性疾病的血清学调查

此试验用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法对规模化猪场的1498份猪血清进行了猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)、猪伪狂犬病(PR)、猪细小病毒病(PP)、猪日本乙型脑炎(JE)、猪瘟(HC)以及猪圆环病毒2型(PCV2)感染的抗体检测。检测结果表明,猪瘟免疫抗体的阳性率为69.0%(156/226);猪细小病毒病、猪日本乙型脑炎和猪伪狂犬病免疫抗体的阳性率分别为79.9%(175/219)、87.2%(191/219)和74.8%(217/290);猪繁殖与呼吸综合征免疫抗体的阳性率为58.8%(67/114),未免疫抗体的阳性率达61.5%(150/244);猪圆环病毒2型感染未免疫抗体的阳性率为66.7%(98/147)。结果表明,引起繁殖障碍的疾病中,猪细小病毒病、猪日本乙型脑炎和猪伪狂犬病的免疫效果较好;而猪繁殖与呼吸综合征的免疫效果较差,并与猪圆环病毒病困扰某些猪场。根据检测结果,提出了相应的防制措施。

公路工程项目建设管理思路与施工技术要点分析

随着科学技术水平的提高,各行各业都受其影响,实现了良好发展。在公路工程项目建设领域中,各类先进技术与工艺不断涌现出来,推动着公路工程行业的发展。在施工过程中,管理工作至关重要,无论施工技术如何先进,都应首先保障施工安全,并注意施工技术要点,提高施工质量。本文主要分析公路工程项目建设管理思路与施工技术要点。

猪鸡致病性大肠杆菌沙门菌对β-内酰胺类药耐药表型和基因检测

本试验指130株细菌对β-内酰胺类药物头孢噻吩、头孢西丁、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟等的耐药表型进行研究。结果大肠杆菌及沙门菌对β-内酰胺类耐药率较高:头孢噻吩83.5%、头孢他啶63.4%。敏感率较高的:头孢曲松93.2%、亚胺培南97%、头孢吡肟100%。采用本实验室建立的三重PCR方法,检测β-内酰胺类药物CTX-M、SHV和TEM耐药基因,TEM的检出率最高82%(82/130),SHV的检出率34%(34/130)、CTX-M检出率23%(23/130)。耐药基因和耐药性比较表明,大肠杆菌及沙门菌对β-内酰胺类药物耐药表型与耐药基因型符合率较高,能很好的反映细菌耐药情况并给临床用药提供参考。

中国西部、北部地区410例汉族病例乙型肝炎病毒基因型与肝病转归的相关性研究

目的探讨乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)基因型与肝病转归的关系。方法随机选取中国西部、北部地区汉族HBV感染者DNA含量104以上者410例,煮沸法提取HBV基因组模板,PCR扩增S区基因,应用自动测序仪测定目的基因序列,进行基因分型,应用SPSS10.0软件统计分析。结果C型占91.95%,B型占6.83%,B、C混合型占0.24%,D型占0.98%。疾病进展研究分4种情形对基因型C、基因型B进行单因素方差分析:慢性病毒携带者(ASC),慢性乙型肝炎(chronic hepatitisB,CHB),肝硬化(liver cirrhosis,LC),原发性肝细胞性肝癌(primary hepatocellular carcinoma,HCC)。统计显示,感染基因型C后CHB更易发展为LC和(或)HCC,有统计学意义,但两基因型之间LC发展为HCC差别无统计学意义。LCvs.(CHB+HCC)统计显示:两组在基因型方面虽无统计学差异,但从Means Plots可以看出感染基因型C向肝硬化或肝细胞癌方向发展的趋势更明显。结论中国西部、北部汉族HBV感染者中以感染基因型C为主,且感染基因型C较基因型B更容易发展为严重的肝病。

创新工场凭什么做到95%的成功率

2016年春节过后,创新工场创始人、董事长李开复带领工场内100多名创业者,15天里拜访了26位硅谷科技大咖,这距离他复出正好一年的时间。2013年9月份,李开复宣布患上淋巴癌,经过17个月的治疗,2015年2月,李开复回到工作岗位。一年时间里,李开复马不停蹄推动创新工场登陆新三板,并组建培训创业者的群英会和兄弟会。

地方政府密集出台新一轮户籍、楼市新政

多年来横亘在中国城乡之间的户口藩篱,正随着经济、社会的发展逐渐被打破。4月9日,中共中央、国务院发文指出,推动超大、特大城市调整完善积分落户政策,探索推动在长三角、珠三角等城市群率先实现户籍准入年限同城化累计互认,同时放开放宽除个别超大城市外的城市落户限制,试行以经常居住地登记户口制度。

睿智的生活,摆脱痛苦和无聊——《蝉》《贝壳》的细节解读

叔本华关于人生的钟摆理论是——人生就是在痛苦和无聊这二者之间像钟摆一样摆来摆去：当你需要为生存而劳作时，你是痛苦的；当你的基本需求满足之后，你会感到无聊。这个说法非常深刻，

绝望中的坦然正视——卡夫卡《变形记》,一个流血的童话

卡夫卡曾说，陀斯妥耶夫斯基是一个流血的童话。其实这句话完全可以形容他自己，唯一不同的是，也许卡夫卡的伤口更深。他的那些童话或者寓言，他的几乎每一部作品，如《城堡》《变形记》《地洞》等等，无一不在昭示着苦痛、绝望和孤独的命题，这些东西被卡夫卡从人类几乎不可能到达的深处挖了出来，很多年以后，人们被卡夫卡的发现震惊了。卡夫卡（1883-1924），奥地利小说家。出生于犹太商人家庭，18岁人布拉格大学学习文学和法律，1904年开始写作。卡夫卡是欧洲著名的表现主义作家。他生活在奥匈帝国行将崩溃的时代，又深受尼采、柏格森哲学影响，对政治事件也一直抱旁观态度，故其作品大都用变形荒诞的形象和象征直觉的手法，表现被充满敌意的社会环境所包围的孤立、绝望的个人，成为席卷欧洲的“现代人的困惑”的集中体现，并在欧洲掀起了一阵又一阵的“卡夫卡热”。

侵犯著作权罪疑难问题探究

侵犯著作权罪的犯罪客体是复杂客体 ,即侵犯著作权的行为在侵犯国家著作权管理制度的同时又侵犯了他人的著作权以及与著作权有关的权益。随着数字化技术的不断发展 ,著作权的内涵与外延在不断地发生变化 ,但从我国目前的实际情况看 ,对侵犯数字化权利的行为不宜定为侵犯著作权罪 ,而对侵犯网络传输与公共传播权的行为可按侵犯著作权罪处罚。侵犯著作权罪的犯罪对象是他人受《著作权法》

刑事证人作证行为法律定位的反思——兼谈《刑事诉讼法》第48条第1款的缺陷及其弥补方法

刑事证人是指犯罪嫌疑人、被告人和被害人之外的、与案件没有直接利害关系的、向公安、司法机关陈述自己耳闻目睹的案件有关事实的个人和单位。作证不应当定位为证人的义务 ,而应当定位为证人的权利。《刑事诉讼法》第 4 8条第 1款的规定存在重大缺陷 ,应将其修改为 :除法律另有规定外 ,所有耳闻目睹案件有关事实的人 (单位 )都有作证的资格。

刑事诉讼中“再生证据”的研究

刑事诉讼中“再生证据”的研究田国宝石英近年来，随着我国反腐肃贪力度的不断加大，一些身处反腐肃贪第一线的司法实际工作者根据对司法实践经验的总结，率先提出了“再生证据”（亦有人称之为“派生证据”）的概念。应该说，这一概念的提出是很有创见性的，而对这一概念...