抗人小细胞肺癌单克隆抗体基因文库的构建

本文通过对压井循环过程的分析，建立了常规压井循环应满足了基本关系，并通过结基本关系的分析，提出了实际压井循环排量应取压井循环允许的最大排量，并给出了求取实际压井循环排量的方法和实例，最后对循环排气时的环空安全问题提出了考查办法。

抗人小细胞肺癌单克隆抗体基因文库的筛选

在引气浮选中，影响除油效率的因素主要是油粒直径、气泡直径和油粒表面的化学性质。加入表面活性剂、聚合物及无机物凝聚剂，可以降低气泡直径、增大油粒直径、降低油粒表面的电位，从而提高除油效率。

集落刺激因子1及其受体的单抗对人肝癌细胞在裸鼠体内生长的抑制作用

探讨集落刺激因子┐１及其受体在人原发性肝癌中的过量表达及其意义。方法抗ＣＳＦ１Ｒ和抗ＣＳＦ１单克隆抗体对裸鼠移植性人肝癌７７２１细胞的生物学作用。结果两个单抗分别以７４．８８％和７７．９３％的体积抑瘤率在裸鼠体内抑制７７２１细胞的生长。结论ＣＳＦ１Ｒ和ＣＳＦ１可能是一新发现的肝癌自泌和旁泌系统。

人血浆转甲状腺素蛋白的提纯及其对肝癌细胞生长的抑制作用

目的:在人原发性肝癌中,转甲状腺素蛋白(transthyretin,TFR)基因转录严重受阻遏.在原发性肝癌患者的血浆中,TTR含量明显降低.因此,有必要从人血浆中提取TTR,观察TIR对人肝癌细胞生长的抑制作用.方法:先用40%饱和硫酸铵,再用5%酚预沉淀人血浆,采用DEAE-Cellulose离子交换层析提取TTR,所提蛋白经蛋白质印迹鉴定并于体外观察TTR对肝癌细胞生长的抑制作用.结果:从血浆中提取的TTR纯度为85%,经蛋白质印迹鉴定正确;体外实验初步证实,TTR对肝癌细胞的生长有明显抑制作用.结论:TTR对肝癌细胞的生长有明显抑制作用,这一性质为生物工程生产TTR,用于临床治疗,提供了可行性依据,从而在蛋白水平进一步证实TTR基因可能是与人肝癌相关的抑癌基因候选者.

新型基因转移系统介导p21基因治疗人脑胶质瘤的体外研究

目的：探索靶向性非病毒载体系统在人脑胶质瘤基因治疗中的应用。方法：组建了ＥＧＦ－Ｒ介导的ＧＥ７基因转移系统，分别与β－ｇａｌ报道基因和ｐ２１基因构成载体复合物，体外转染Ｕ２５１细胞，通过Ｘ－ｇａｌ染色、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析、原位末端标记、ＤＮＡ梯带检测等，观察了外源基因的导入及对肿瘤细胞的抑制作用。结果：Ｘ－ｇａｌ染色表明，外源基因的导人率可达８０％；转染ｐ２１基因后，细胞生长受到明显抑制，第７天生长抑制率约５８％。原位末端标记及 ＤＮＡ梯带检测发现，转染细胞有明显的凋亡发生。结论：ＧＥ７载体系统能高效靶向地将外源基因导入肿瘤细胞，外源基因的表达可明显抑制肿瘤细胞的生长，有效诱导其凋亡。

靶向于胰岛素样生长因子受体的基因导入系统

目的 建立一种新的以细胞表面受体为靶向的基因导入系统。方法 根据胰岛素样生长因子Ⅰ号及Ⅱ号受体(IGFIR,IGFⅡR)在人原发性肝癌中过量表达,设计并合成了针对IGFIR及IGFⅡR的14肽E5,同时合成了流感病毒血凝素功能域20肽HA20作为内吞小体释放寡肽(Endosomereleasing oligopeptide,EROP),将它们分别与多聚阳离子多肽(Polycationic polypeptide,PCP)-多聚赖氨酸(Polylysine,PL)共价连接,通过静电效应与DNA形成受体介导的靶向性非病毒型基因导入系统(E5-PCP,PCP-HA20)。结果 体内、外实验证实此基因导入系统能高效且相对靶向地将外源基因导入人肝癌细胞并表达。应用此系统将细胞周期素依赖的蛋白激酶抑制物基因p15,pl6,p21导入肝癌细胞,明显抑制肝癌细胞生长。体内将p21导入荷瘤裸鼠,显著抑制裸鼠皮下肿瘤的生长。结论 受体介导的非病毒型基因导入系统高效且具有相对靶向性,有可能成为新的肝癌基因治疗途径。

裸鼠肿瘤动物模型VEGF受体表达及其意义

目的 通过免疫组织化学染色了解flt 1与flk 1 KDR(VEGF的两个高亲和受体 )在人肿瘤细胞皮下接种肿瘤动物模型的血管内皮细胞与肿瘤细胞中的表达。方法 取荷瘤裸鼠皮下接种瘤块 ,漂洗、固定、石蜡连续切片 ,进行两种受体相应免疫组化检测。结果 在 13种荷瘤裸鼠血管内皮细胞及肿瘤细胞中flt 1的阳性率大部分为强阳性或中阳性 ,而只有在荷人胃腺癌MKN 4 5裸鼠的肿瘤细胞中flt 1的阳性率为弱阳性 ,在荷人卵巢癌SKOv3裸鼠的肿瘤细胞中flt 1的表达为阴性。相比较而言 ,在 13种荷瘤裸鼠血管内皮细胞及肿瘤细胞中KDR的阳性率大部分为中阳性或弱阳性 ,并且在荷人肝癌SMMC 772 1裸鼠 ,荷人胃腺癌SPC A1裸鼠 ,荷人高转移肝癌移植瘤裸鼠 ,荷人卵巢癌SKOv3裸鼠的肿瘤细胞中 ,荷人宫颈癌移植瘤裸鼠和荷人胃腺癌MKN 4 5裸鼠的肿瘤细胞中 ,KDR表达为阴性。结论 VEGF受体共同表达于肿瘤血管内皮细胞与肿瘤细胞 ,提示了VEGF与VEGF受体结合作用在肿瘤演化中的重要性 。

GE7导入系统介导抑癌基因NOEY2体内导入治疗人上皮性卵巢癌裸鼠网膜移植瘤的研究

目的 :研究GE7导入系统体内导入效率及介导抑癌基因NOEY2体内导入后对人上皮性卵巢癌裸鼠网膜移植瘤的治疗作用。方法 :将人上皮性卵巢癌细胞株Hey细胞种植于裸鼠皮下成瘤后半包埋缝于裸鼠脾区网膜建立网膜移植瘤模型。将GE7- β -gal四元复合体经腹腔注入荷瘤鼠体内用X -gal染色法检测基因导入效率 ,同法导入生理盐水、GE7-pcDNA3四元复合体及GE7-pcDNA3-NOEY2四元复合体 ,研究其抑制肿瘤生长的作用。结果 :人上皮性卵巢癌裸鼠网膜移植瘤的成瘤率达 10 0 % ,3周后瘤体达 3 68± 0 82g。GE7- β -gal四元复合体经腹腔注入荷瘤鼠体内 12h后 β -gal即有表达 ,4 8h后以瘤体、肝、脾表达率最高。GE7-pcDNA3-NOEY2四元复合体腹腔注射 3周后瘤体生长抑制率为 4 0 81% (P <0 0 5)。结论 :人上皮性卵巢癌裸鼠网膜移植瘤模型具有实用性。GE7导入系统体内导入基因效率高 ,具有相对肿瘤靶向性。GE7导入系统介导抑癌基因NOEY2体内导入后能有效抑制上皮性卵巢癌的生长。

表皮生长因子受体介导的多肽载体系统对人喉鳞状细胞癌的基因导入研究

目的 检测一种新的以头颈肿瘤细胞表面受体为靶向的多肽基因导入系统对人喉鳞状细胞癌 (简称鳞癌 )的基因导入效果。方法 链霉亲和素标记生物素 (labeledstreptavidinbiotin ,LSAB)法检测喉癌组织标本和培养的Hep2喉癌细胞表皮生长因子受体 (epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)的表达。建立人喉癌裸鼠移植瘤模型 ,分别构建绿色荧光蛋白标记基因和多肽载体系统、半乳糖苷酶报告基因和多肽载体系统四元复合物 ,分别进行报告基因和标记基因的体内外导入实验。结果 EGFR在 6 5 % (15 / 2 3)喉癌组织标本呈阳性表达。Hep2细胞的EGFR亦呈阳性表达。EGFR主要位于细胞膜 ,部分位于细胞质内。绿色荧光蛋白基因转染Hep2后 4 8h显微镜下可见荧光 ,72h达高峰 ,导入率大于 80 % (78/ 97)。β 半乳糖苷酶报告基因荷人喉癌裸鼠移植瘤瘤内转染 12h即表达蓝染 ,2 4h蓝染程度加深 ,72h仍有表达。 结论 EGFR广泛存在于人喉癌细胞 ,新的多肽基因导入系统借助于EGFR可靶向性将报告或标记基因导入体内外人喉癌细胞 ,并得到高效表达 ,为头颈鳞癌的基因治疗提供了一个新的靶向高效的基因导入系统。

多聚阳离子对非病毒载体转移效率的影响

目的：了解鱼精蛋白应用于血管内皮生长因子受体介导的靶向性非病毒载体的可行性。方法：利用ＧＶ１，ＧＶ２靶向性非病毒载体来比较多聚赖氨酸与鱼精蛋白对靶向性基因转移复合体携带ＤＮＡ的能力及体外基因转移效率的影响。结果：在Ａ３７５细胞中，鱼精蛋白与多聚赖氨酸参与形成的复合体基因导入率都为５０％左右。在ＡＢＡＥ细胞中，鱼精蛋白参与形成的复合体基因导入率只有２０％左右，而多聚赖氨酸可达７０％左右。鱼精蛋白参与形成的复合体导入引起的基因表达在转染后第６天达到高峰，传代培养不影响基因的表达水平；多聚赖氨酸在转染后第７天达到高峰，传代培养使基因的导入率明显下降。结论：鱼精蛋白在血管内皮生长因子受体介导的基因转移系统中的应用具有一定的限制性。

联合基因治疗肿瘤研究新进展

肿瘤基因治疗研究发展迅速 ,现已出现多种治疗方案 ,有些已应用于临床。针对肿瘤发生的复杂性和多样性 ,将几种治疗方案进行有效联合以提高疗效是目前工作的新热点。本文对近年国内外联合基因治疗的几个方面作一简要综述。

表皮生长因子受体介导的新型肝癌靶向性基因转移

如何使得外源基因稳定地从吞噬溶酶体中释放 ,是提高受体介导基因转移系统转移效率的关键。本文以绿色荧光蛋白质粒为报告基因 ,合成针对表皮生长因子受体 (EGFR)的相应 16肽配体寡肽和流感病毒血凝素HA2 0寡肽 ,并与多聚赖氨酸连接 ,连接物与绿色荧光蛋白报告基因按 1∶1混合 ,构建新型肝癌靶向性转移系统 ,命名为四元复合体。分别以四元复合体和脂质体在体内外进行基因转染 ,流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测绿色荧光蛋白表达。结果表明 ,四元复合体介导基因定向转染至肿瘤细胞 ,其转染率为 44 95 % ,显著高于脂质体转染组( 3 3 0 9% ,P <0 0 5 ) ,动物实验证明 ,四元复合体介导绿色荧光蛋白特异性表达于肿瘤细胞 。

受体介导的基因转移与基因治疗

基因治疗成功的关键在于将治疗基因靶向性转移到细胞或组织,受体介导的基因转移能满足此要求,很有发展潜力的基因转移方法。然而,要将这种转移方法用于基因治疗,与转移系统有关的万分的化学特性与物理反应,靶细胞的受体表达水平,DNA配体复合物怎样逃逸溶酶体的降解以及包含在复合物中的外源基因的表达等都是至关重要的。本文综述了受体介导的基因转移的基本原理。DNA配体复合物形成的最佳条件与性质,影响基因转移与表达的各种因素以及近年来国内外受体介导的基因转移用于基因治疗取得的进展。

抑制肿瘤血管生成治疗肿瘤的研究进展

抑制肿瘤新生血管生成是治疗肿瘤的新途径。目前的研究重点是通过抑制内源性促血管生成因子 ,利用内源性血管生成抑制因子和外源性血管生成抑制因子来抑制血管生成。

抗人小细胞肺癌单克隆抗体的重链变区基因的体外扩增、克隆和序列分析

本文从抗人小细胞肺癌单克隆抗体杂交瘤细胞中抽提总RNA,合成第一链cDNA,直接用PCR技术(polymerase chain reaction)扩增出351bp的重链变区基因(V_H),克隆至pUCV_(NP)-PCR载体上,经筛选得一批插入片段为351bp的阳性克隆,经核苷酸序列分析研究,证实已获得了该单克隆抗体的重链可变区基因。

免疫球蛋白变区基因的体外扩增及人－鼠嵌合抗体的表达

应用聚合酶链反应法体外扩增抗人小细胞肺癌单克隆抗体的变区基因，经核苷酸序列分析，轻链变区基因为３２４ｂｐ，编码１０８个氨基酸；重链变区基因为３５１ｂｐ，编码１１７个氨基酸。将重链变区基因克隆至ｐＳＶ_２△ＨｇｐｔＨｕγ_３质粒，经一系列克隆、筛选，得一插入方向正确的表达人－鼠嵌合重链抗体的载体－ｐＳＶ_２△Ｈｇｐｔ２Ｆ７ＶＨＨｕγ_３。用电穿孔方法将该质粒导入鼠源骨髓瘤细胞Ｊ５５８Ｌ，用霉酚酸进行初步筛选，最终用兔抗人免疫球蛋白ＩｇＧＦｃ片段的抗体筛选得七株阳性克隆，免疫印迹法结果表明在与人ＩｇＧ相同位置上有一阳性条带。

肿瘤中血管内皮生长因子的表达

肿瘤生长与转移依赖于血管生长。血管生长因子直接或间接地刺激宿主的免疫细胞或基质细胞,促进内皮细胞的增殖与迁移,最终导致血管生长。许多生长因子都可以刺激血管的生长,尤其是血管内皮生长因子(vasuclarendothelialcellgrowthfactor,VEGF)[1],但目前肿瘤中支持血管生...

非病毒载体系统在基因治疗中的应用

非病毒载体系统具有低毒、低免疫原性和相对靶向性等优点 ,是新兴发展起来的基因转移系统。本文综述了目前基因治疗中所用的几种非病毒载体系统及其研究进展。

聚合酶链反应法扩增免疫球蛋白变区基因

用异硫氰酸胍抽提抗人小细胞肺癌单克隆抗体杂交瘤细胞株2F7的总RNA,用逆转录酶合成第一链cDNA,用PCR技术扩增出351 bp的重链变区基因(V_H)和324bp轻链变区基因(V_L),分别克隆至pUCV_(NP)-PCR和pWR13载体上,经筛选和DNA序列分析研究,证实已获得了该单克隆抗体的变区基因.