微小隐孢子虫种特异性基因片段的克隆及诊断引物的确定

目的 寻找用于诊断微小隐孢子虫病的特异性引物。 方法 在RAPD分析过程中获得了 1条微小隐孢子虫 [Cryptosporidium parvum (C .parvum ) ]种特有 712bp的基因片段 ,将该片段分离、纯化、克隆和测序 ,据此序列合成一对特异性引物FF。用引物FF扩增美国 2株C .parvum和中国 4株C .parvum ,并用该引物与Morgan( 1996 )发表的C .parvum种特异性诊断引物 0 2 1作对照 ,检测镜检C .parvum卵囊阴性的兔粪样 35份和人粪样 5 5份。 结果 引物FF扩增 6株C .parvum均能产生预计 6 0 3bp的片段 ,引物FF和引物 0 2 1粪样检测结果完全一致 ,其敏感性是可检出 1个卵囊的DNA。 结论 获得的引物FF特异性强 ,敏感性高 ,可用于微小隐孢子虫病的诊断。

家蚕胚胎期重力相关基因的抑制消减杂交分析

目的:筛选家蚕胚胎期重力相关基因。方法:对模拟失重与正常重力条件下的家蚕胚胎cDNA进行抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH),并对模拟失重过程中家蚕胚胎期表达发生变化的基因进行克隆、测序及同源性分析。结果:获得了34个与重力有关的序列标签。在模拟失重条件下有16个基因表达上调,其中15个为未知基因,1个为已知基因,其作用是维持mRNA的稳定性。在模拟失重条件下有18个基因表达下调,其中4个为未知基因,6个为蛋白合成相关基因,3个为基因组contig基因,5个为家蚕est库中功能未知基因。结论:模拟失重环境影响了家蚕胚胎发育期与mRNA稳定性和蛋白质合成相关基因的表达。

中国人源蓝氏贾第虫病毒基因组全长cDNA克隆及序列测定

从中国人源蓝氏贾第虫北京株 ( BEIJ88/ BTMR1/ 1)体外纯培养的电镜负染和超薄切片观察到蓝氏贾第虫病毒粒子。该病毒位于感染早期贾第虫的细胞质中 ,感染晚期的细胞核中。根据国外发表的蓝氏贾第虫病毒序列设计了 6对互相重叠的引物。用这 6对引物对从中国人源蓝氏贾第虫北京株发现的蓝氏贾第虫病毒基因组进行 RT- PCR,将产物连接到 p MD18- T载体中并转化入 DH5 α感受态菌 ,送上海生工测序 ,通过 BL AST对 Gen- Bank进行同源性搜索。结果测得我国人源蓝氏贾第虫病毒基因组全长为 6 2 73bp,与国外报道的蓝氏贾第虫病毒序列同源性为 95 % ,编码的氨基酸同源性为 90 %。

家蚕3-羟基异丁酸脱氢酶基因克隆及其在模拟失重环境中的表达模式分析

采用RT-PCR和RACE技术克隆了家蚕3-羟基异丁酸脱氢酶(hibadh)基因全长cDNA(GenBank登录号EU719652)并对其序列进行了分析,用RT-PCR方法检测了hibadh基因在家蚕5龄幼虫不同组织中的分布,最后用real-timeRT-PCR方法分析了整个胚胎期家蚕hibadh基因在模拟失重环境中的表达模式。克隆的hibadh基因cDNA全长1074bp,包含1个能编码完整Hibadh长度为969bp的开放阅读框。家蚕hibadh基因与伯霍尔德杆菌、果蝇、蜜蜂、热带爪蟾、小鼠、人类等6个物种hibadh基因推导的氨基酸序列同源性分别达到46%、43%、48%、44%、45%、45%。Hibadh蛋白为分泌蛋白,不存在糖基磷脂酰肌醇锚定位点,分子量和等电点分别为34.1kD和9.14。hibadh基因在家蚕5龄幼虫的头、丝腺、中肠、皮肤、血液、脂肪体、马氏管等组织中稳定表达。模拟失重环境中家蚕hibadh基因在胚胎发育的不同时期表达量不同,胚体突起发生期和反转期hibadh基因表达量分别上调2.3倍(P<0.05)和4.6倍(P<0.01),气管形成期hibadh基因表达量下调7.6倍(P<0.01),其余时间段hibadh基因表达量没有明显变化。整个胚胎发育期内,模拟失重组与对照组相比较hibadh基因总表达量下调2.6倍(P<0.05)。在模拟失重环境中,家蚕hibadh基因的表达模式与家蚕整体的响应模式有相似之处但不尽相同。基因对环境反应的灵敏度高于有机体整体对环境反应的灵敏度。该研究有利于进一步探讨hibadh基因的重力生物学机制。

人源蓝氏贾第虫(Giardia lamblia)病毒部分基因的克隆及序列分析

目的 从我国蓝氏贾第虫 (Giardialamblia)中寻找贾第虫病毒。方法 对人源贾第鞭毛虫北京株进行了体外纯培养 ,将其总核酸电泳 ,并用DNA酶和RNA酶处理。根据已发表的蓝氏贾第虫病毒基因序列合成一对引物并进行RT PCR ,将产物回收后连接到Pmd18 T载体上进行克隆并测序 ,通过BLAST对GenBank进行同源性搜索。结果 在贾第虫总核酸电泳图谱上观察到一个分子量约 7 0kb的片段。该核酸不能被DNA酶 (10 0 μg/ml)降解。但可被RNA酶 (10 μg/ml)降解。经RT PCR扩增后得到 1条预计 85 6bp的片段 ,所得序列与蓝氏贾第虫病毒基因同源性为 98%。结论 在我国人源贾第鞭毛虫北京株中发现贾第虫病毒 。

家蚕动力蛋白轻链8基因克隆及其对重力的响应

克隆家蚕动力蛋白轻链8(dynein light chain 8,Dlc8)基因开放阅读框架并对其序列进行分析.探讨Dlc8基因在家蚕胚胎、头、丝腺、中肠、皮肤、血液、脂肪和马氏管等组织中的分布.在细胞水平,应用RT-PCR和实时定量RT-PCR方法分析大梯度强磁场(large gradient high magneticfield,LGHMF)重力模拟环境(0g、1g、2g)对家蚕Dlc8基因表达的影响.在整体水平,应用实时定量RT-PCR方法分析Dlc8基因在家蚕胚胎反转期和整个胚胎期对LGHMF模拟失重环境的响应.克隆的家蚕Dlc8基因开放阅读框架长度为270bp,编码89个氨基酸.家蚕Dlc8基因推导的氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、果蝇(Drosophila melanogaster)、线虫(Caenorhabditis elegans)、热带爪蟾(Xenopus tropicalis)、小鼠(Mus musculus)、人类(Homosapiens)等6个物种Dlc8基因的氨基酸序列同源性分别为67%、96%、91%、95%、92%、92%.信号肽分析结果显示,该蛋白质为非分泌蛋白,不存在糖基磷脂酰肌醇锚定位点.家蚕Dlc8分子质量与等电点分别为10.34ku和6.81.Dlc8基因在家蚕的胚胎、头、丝腺、中肠、皮肤、血液、脂肪、马氏管中稳定表达.在细胞水平,家蚕Dlc8基因表达对重力变化较敏感,对磁场变化不敏感.在整体水平,Dlc8基因在家蚕胚胎发育的不同时期对重力的响应不同.整个胚胎发育期Dlc8基因在模拟失重条件下表达量与对照组接近.家蚕Dlc8基因可以作为重力生物学效应研究的分子靶标.该研究为深入探讨家蚕Dlc8基因重力生物学效应机制奠定了基础.

人源蓝氏贾第虫病毒GLV1518-2322基因的表达及表达产物抗血清的制备

根据中国人源蓝氏贾第虫病毒 (GLV)全基因组测序结果 ,将其全基因组cDNA上编码贾第虫病毒部分衣壳蛋白的GLV1 5 1 8 2 3 2 2基因克隆到原核表达载体pET 2 8c ( +)上 ,构建了原核表达重组质粒pET 2 8c( +) GLV1 5 1 8 2 3 2 2。SDS PAGE分析表明 ,经IPTG诱导 ,3 2kDa蛋白基因在大肠杆菌BL2 1 (DE3 )pLysS中得到高效表达。以纯化的表达产物为抗原 ,免疫BalB c小鼠 ,同时用病毒粒子免疫BalB c小鼠 ,制备了中国人源蓝氏贾第虫病毒GLV1 5 1 8 2 3 2 2蛋白特异性抗血清 ,ELISA方法测得的纯化蛋白最适抗原包被浓度为1 40 0和病毒粒子抗血清最佳工作浓度为 1 2 0 0。

应用RAPD技术对鸡柔嫩艾美耳球虫不同地理株的多态性研究

利用RAPD技术对鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)GZ株、HB株、JL株及HB株与JL株杂交虫株FZ1进行了研究。结果表明:E.tenella不同地理株间及同一地理株亲代与子代间均存在DNA多态性。其中不同地理株间种内变异程度较大(SI=0.6225～0.6977)。而同一地理株子代与亲代间也发生遗传变异,但变异程度不大(SI=0.9813～0.9910)。同时对本室培育的HB株与JL株的杂交虫株FZ1的基因组DNA进行RAPD分析,发现该杂交株与其亲本HB株、JL株的相似值为0.8215,0.7916,大于HB株与JL株间相似值(0.6977),小于传代虫株间的相似值(0.9813～0.9910),且其扩增条带显示出与亲本株间的相似,且又有不同,表明该杂交虫株是1株既具有两亲本株的遗传性状,又发生了变异的虫株。

抗隐孢子虫子孢子表膜单链抗体基因的克隆和核苷酸序列分析

应用 RT- PCR技术 ,从分泌具有抗隐孢子虫子孢子表膜单克隆抗体 (Mc Ab)的杂交瘤细胞 3D6中扩增出抗体VH 和 VL 基因 ,用 linker(Gly4 Ser) 3基因 ,将 VH 和 VL 基因连接成 Sc Fv基因 ,并将其克隆至 p MD- 18T载体中。经核苷酸序列分析证实 ,VH、VL 基因和 linker基因拼接正确 ,基因全长为 72 0 bp。经计算机分析 ,VH 和 VL 基因均为新发现的基因序列 ,符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征。VH和 VL 基因分别属于鼠免疫球蛋白重链 (A)和轻链 κ 家族。

随机定位模拟微重力促进人前破骨细胞增殖和分化

目的观察随机定位模拟微重力对人前破骨细胞FLG29.1增殖和分化的影响。方法 FLG29.1细胞分为正常对照组与随机定位处理组,分别培养72 h后收集细胞。采用细胞计数法检测细胞总数和活细胞数;流式细胞术检测细胞周期;Griess法检测培养基中NO(nitric oxide,NO)浓度;抗酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)染色计算TRAP阳性细胞比例;对硝基苯磷酸(pNPP)法检测胞内TRAP活性。结果随机定位处理后,FLG29.1细胞增殖能力与活细胞比例均较对照组明显增加;细胞周期分布发生变化,处于G1期的细胞比例增加;培养基中NO浓度有增加趋势;在回转处理的同时添加诱导剂12-氧-十四烷酰佛波醋酸酯-13乙酸酯(TPA),发现TRAP阳性细胞数量增多;胞内TRAP活性较对照组明显增加。结论随机定位模拟微重力提高了FLG29.1细胞活力并促进其向破骨细胞分化。

火鸡隐孢子虫18S核糖体DNA部分序列测定与系统发育分析

从长春地区鸭的粪便中分离纯化了火鸡隐孢子虫 (Cryptosporidiummeleagridis )卵囊 ,根据隐孢子虫 18SrDNA基因序列设计合成引物 ,用PCR扩增了卵囊基因组DNA大小 5 86bp的片段 ,PCR产物经电泳鉴定后用试剂盒回收纯化 ,纯化后PCR产物直接测序。将测得的序列用Dnastar软件分析并与国外已发表的相应序列进行了同源性比较 ,并绘制了系统发育进化树。结果初步建立了火鸡隐孢子虫的PCR检测方法 ,序列分析显示长春鸭源火鸡隐孢子虫与国外 9株隐孢子虫相应序列同源性在 82 7%～ 99.8%之间 ,其中与国外火鸡源火鸡隐孢子虫相应序列同源性为 85 .3% ;与C .felis同源性最低 ,与C .muris同源性最高。

微小隐孢子虫18SrRNA部分基因克隆和序列分析

分别从长春小白鼠、徐州人和南京黄牛的粪便中分离纯化了 3株微小隐孢子虫 (C .parvum)卵囊 ,根据C .parvum 18SrRNA基因序列设计合成引物 ,用PCR扩增卵囊基因组DNA ,其大小为 5 86bp的片段 ,PCR产物用试剂盒回收纯化后直接测序。将测得的序列用DNASTAR软件分析并与国外已发表的相应序列进行同源性比较 ,并绘制系统发育进化树。结果表明 ,徐州人源株与长春鼠源株及徐州人源株与南京黄牛源株同源性均为 97 6 % ;长春鼠源株与南京黄牛源株相应序列同源性为 99 6 %。此 3株C .parvum与国外株相应序列同源性为 81 4 %～ 10 0 0 %。限制性内切酶酶切位点分析仅发现徐州株有 1个特殊的DdeⅠ位点。

抗磁性物质磁悬浮方法在空间生物学与生物技术中的应用

失重是特定空间运动条件下的重要环境物理特征之一,一般以微重力环境来表示.几十年来人类利用空间失重环境进行了多学科领域的科学研究与探索.由于真实空间失重环境下科学实验机会稀少,人类为研究空间失重环境或效应,开发了多种地基的空间模拟实验技术方法.然而,对于空间生物学和空间生物技术研究而言,已有的各种模拟实验技术手段在原理上和应用上均存在一定的局限性.本文介绍了抗磁性物质在大梯度强磁场中的悬浮现象,及将其用于模拟空间失重环境的方法与原理;简述了近年来利用抗磁性物质悬浮方法进行生物大分子晶体生长、分子细胞生物学及整体生物学等方面研究与应用的进展.

用蔗糖密度梯度离心法纯化小球隐孢子虫卵囊试验

用蔗糖密度梯度离心法从接种犊牛粪便中纯化小球隐孢子虫卵囊 ,该方法操作简便、快速、经济、获得的卵囊纯度高 ,回收率达 92 .0 % ,适合于国内普通实验室使用。

破骨细胞研究进展

破骨细胞起源于造血干细胞,主要功能是进行骨吸收,在骨重塑中起着重要的调节作用。破骨细胞的形成和活性异常可引起一系列骨骼疾病,因此,近年来破骨细胞已成为骨骼疾病研究的靶细胞,同时,它也是失重环境中骨丢失发生机制研究的热点,本文就破骨细胞的分化、功能及其功能异常产生的影响等方面研究内容进行综述。

犬贾第虫dsRNA病毒的鉴定及特性

对分离到的 6株犬贾第虫 ( Giardia canis)包囊进行核酸分析 ,在其中 1株犬贾第虫核酸的琼脂糖凝胶电泳图谱上观察到 1条长度约 7.0 kb的片段。经鉴定 ,该核酸不能被 DNA酶 ( 1 0 0 mg/ L)降解 ,对质量浓度低的 RNA酶 ( 0 .1 mg/ L)不敏感 ,但可被质量浓度高的 RNA酶 ( 1 0 mg/ L)降解。纯化包囊经液氮冻融后 ,磷钨酸负染 ,电镜观察发现有球形、直径约为 33nm的病毒样粒子存在 ,包囊超薄切片在胞质中也观察到该病毒样粒子存在。RNA依赖 RNA聚合酶活性测定结果表明 ,该病毒具有 RNA依赖 RNA聚合酶的活性。犬贾第虫 ds RNA病毒核酸经 RT-PCR扩增后得到 1条预计扩增大小的片段 ,将其回收后连接到 p MD1 8-T载体上进行克隆并测序 。

深空辐射生物学效应研究进展

对深空领域进行探测将成为世界范围航天技术发展的重要方向之一。研究深空辐射生物学效应,可以为航天员生命健康保障提供理论指导。本文综述了近年来这方面的一些进展,在细胞和模式动物方面的研究表明,深空或地基模拟的辐射环境能造成DNA双链的断裂和染色体畸变的增加,导致基因组的不稳定性,从而影响了很多生理功能。

隐孢子虫(Cryptosporidium)病毒的鉴定及其特性

根据已发表的隐孢子虫病毒的序列 ,设计合成 2对引物 ,对小球隐孢子虫 ( Cryptosporidium parvum)、鼠隐孢子虫 ( C.muris)、贝氏隐孢子虫 ( C.baileyi)、火鸡隐孢子虫 ( C.meleagridis)进行 RT-PCR扩增 ,结果发现仅小球隐孢子虫 ( C.parvum)含有大小约为 1 .7× 1 0 3nt和 1 .3× 1 0 3nt2个片段的 ds RNA病毒。将其PCR产物连接到 p MD1 8-T载体上进行克隆测序 ,经与 Gen Bank比较 ,含这 2个片段的 ds RNA病毒与已发表的该虫病毒的同源性分别为 96%和 98%。电泳鉴定发现 ,该病毒对低浓度 RNA酶不敏感 ,且不能被 DNA酶降解。依赖 RNA的 RNA聚合酶活性测定结果表明 ,该病毒具有该聚合酶的活性。电镜观察未发现存在病毒样粒子。