猪RNA聚合酶Ⅱ单克隆抗体的制备与应用

旨在制备猪RNA聚合酶Ⅱ的单克隆抗体并进行初步应用。本研究采用生物信息方法预测免疫原,将其化学合成后免疫5只4~8周龄Bal b/c雌性小鼠,对免疫后呈现阳性的小鼠进行细胞融合试验,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合并获得能稳定分泌抗RNA PolⅡ的杂交瘤细胞。鉴定结果显示,RNA PolⅡ单克隆抗体的重链为IgG 2A型,轻链为Kappa型。利用间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了8株稳定分泌RNA PolⅡ单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将其初步应用到染色质免疫共沉淀(ChIP-seq)技术,并与商业化抗体的富集性进行比较,结果表明,本研究得到的单克隆抗体富集性更强。本研究获得的猪RNA PolⅡ单克隆抗体可为表观遗传学的研究提供理论基础,并且提供重要的生物学材料。

北极狐MITF基因启动子及转录因子的研究

为了对北极狐小眼畸形相关转录因子（MITF）基因启动子进行预测及对转录因子进行分析,以家犬MITF基因序列为参考,设计引物并利用PCR扩增获得北极狐MITF基因启动子区,通过TSSW和TSSG等软件对北极狐MITF基因启动子、转录因子等进行预测和分析。结果表明：北极狐MITF基因的-2 154 bp处为候选启动子区,核心启动子区在-242--193 bp处,转录起始位点在-202 bp处;北极狐MITF基因的启动子区无CpG岛,结构较为简单,无甲基化现象,但存在与毛色有关的Sp1、CREB和ATF等转录因子,推测这些转录因子可能影响北极狐毛色的代谢通路。

LbCas12a蛋白的原核表达及活性检测

【目的】获得具有体外切割活性的来自毛螺旋菌属(Lachnospiraceae)ND2006的LbCas12a蛋白,以期为LbCas12a的应用研究提供重要的生物学工具。【方法】根据pMBP-LbCas12a质粒(Addgene,113431)的基因序列合成LbCas12a基因,并将其与pET-28a(+)线性化载体进行同源重组,构建重组质粒pET28a-LbCas12a,经测序和NheⅠ、SalⅠ双酶切鉴定后将阳性重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行IPTG诱导表达。通过12%SDS-PAGE凝胶电泳检测确定IPTG诱导的最佳浓度及温度,鉴定重组蛋白的表达形式,通过Ni-NTA树脂亲和层析的方法进行纯化、超滤法浓缩,BCA法检测蛋白浓度。将浓缩后的LbCas12a与猪细小病毒(PPV)靶标DNA、CRISPR RNA(crRNA)及偶联荧光基团的非特异性单链DNA(ssDNA)探针FQ共孵育,设置1个无LbCas12a蛋白的对照组、4个不同蛋白浓度(125、250、500、1000 nmol/L)的试验组,检测不同组别ssDNA探针的荧光强度,检测测试位点PPV活性。【结果】测序和NheⅠ、SalⅠ双酶切鉴定结果表明,重组质粒pET28a-LbCas12a构建成功且无移码突变。12%SDS-PAGE凝胶电泳检测结果表明,IPTG诱导表达的最佳浓度为0.5 mmol/L,最佳温度为37℃,表达形式主要为可溶性表达。蛋白浓度检测结果表明,浓缩后的蛋白浓度为485 ng/μL,质量为143 ku。活性检测结果表明,125、250、500、1000 nmol/L LbCas12a蛋白组的荧光强度均极显著高于对照组(P<0.01)。【结论】本研究成功表达出高活性的LbCas12a蛋白,且LbCas12a蛋白具有体外切割ssDNA的反式活性,为后续基于CRISPR-LbCas12a系统的分子检测技术奠定了基础。

增强子功能鉴定及其在农业动物中的研究进展

真核生物的基因转录受多种元件共同调控,其中增强子是重要的顺式作用元件,能够极大促进基因的转录。增强子的功能与细胞、组织、个体的特异性功能或表型密切相关,其异常功能往往导致性状改变和疾病发生。因此,研究增强子的功能对于揭示表型背后的分子机理具有十分重要的生物学意义,对于农业动物科学显得尤为重要。本文就增强子的特性、鉴定方法、活性检测以及在农业动物研究中的进展进行综述,以期能够对增强子的相关研究提供依据和参考。