青少年网络不道德行为与父母教养方式的关系——道德脱离、责任心、道德同一性的中介作用

研究采用问卷法,对764名青少年进行测试,用结构方程模型检验了教养方式、责任心、道德同一性、道德脱离和网络不道德行为之间的关系模型。结果表明,拒绝型教养方式通过责任心、道德同一性和道德脱离的中介来间接影响网络不道德行为。责任心可以直接作用于网络不道德行为,也可以通过道德脱离的中介来影响网络不道德行为。道德同一性只能通过道德脱离来影响不道德行为。

细粒棘球绦虫表面抗原热休克蛋白抗体在免疫组化中的应用

目的用生物信息工具分析细粒棘球绦虫表面抗原热休克蛋白70(EgHSP70)的理化性质、结构域等信息,并制备多克隆抗体进行人、羊、小鼠肝包虫病的免疫组化研究。方法EgHSP70氨基酸序列经NCBI数据库中下载,用ProtParam(性质)、SignalP-5(信号肽)、SOSUI(亚细胞定位)、ProtScale、SOSUI、DNASTAR(亲疏水性)、SOMPA(二级结构)、Swissmodel(三级结构)、TMHMM(跨膜区域)工具分析。制备多克隆蛋白抗体,分别进行人、绵羊、C57BL/6J小鼠肝包虫的免疫组化染色。结果EgHSP70是由258个氨基酸序列组成,分子式为C 1248 H 2024 N 354 O 392 S 2,不稳定指数为42.00,为亲水蛋白,无信号肽,无跨膜区,且定位于细胞质中。二级结构中,α螺旋占47.29%,β折叠占16.28%,β转角占8.53%,无规则卷曲占27.91%。免疫组化结果显示,EgHSP70多克隆抗体能够在细粒棘球绦虫的生发层(包囊)细胞中高表达,在羊、C57小鼠正常肝组织中少量表达,在人肝脏组织中不表达。结论免疫组化检测EgHSP70的多克隆抗体在不同的物种组织中,能识别生发层细胞及细粒棘球蚴虫体细胞。

胚胎干细胞发育相关基因PLK1在细粒棘球绦虫体外不同发育时期差异表达研究

目的探究PLK1基因在细粒棘球绦虫不同发育时期的表达情况。方法体外培养细粒棘球绦虫原头蚴在犬胆汁刺激下向成虫方向发育,收集不同发育时期的虫体,通过免疫组化定位PLK1基因的表达。光学显微镜下切割分离成虫头节和后颈节段,收集样本运用荧光定量qPCR量化PLK1基因在虫体不同发育时期或不同部位的表达量水平,用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析。结果成功建立了细粒棘球绦虫原头蚴向成虫方向发育的体外培养模型,体外培养的虫体56 d获得4个节片;PLK1基因在细粒棘球绦虫包囊生发层中高表达量。虽然在成虫和原头蚴表达较低,但免疫组化显示在原头蚴吸盘的底部和成虫头节的下部链体延长区域的表达高于其他部位(F=14.87,P<0.05)。结论细粒棘球绦虫干细胞相关基因PLK1的表达明显位于生发层细胞和激活原头蚴的头节底部以及链体增长区域,PLK1是棘球绦虫成虫发育干细胞区域的高表达基因。

泡球蚴肝门静脉注射感染小鼠方法的建立

建立实验小鼠泡球蚴(AE)肝门静脉感染模型。将腹腔感染的昆明(KM)小鼠剖检后,分离多房棘球绦虫(E.multilocularis)原头蚴(PSCs),胃蛋白酶消化后进行活性检测并计数,再经肝门静脉注射2000个PSCs,剖检不同期实验小鼠,取肝脏制作病理切片、HE及Masson染色,分析不同期病灶数量及纤维化差异。结果显示,小鼠感染PSCs后形成肉芽肿及肝纤维化反应,在6个月(M)时,实验小鼠成“泡”率最高,达到50.00%,3个月(37.50%)及1个月(12.50%)次之,空白对照组(CON)未见成“泡”感染;感染强度次序为:6个月>3个月>1个月>CON。HE及Masson染色显示,实验组与CON病灶数及肝脏纤维化程度与相比差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.001)。上述结果表明肝门静脉感染方式可建立稳定的实验小鼠泡球蚴感染模型,可为泡球蚴的免疫学、药物筛选及其他后续的研究提供一个良好的动物感染模型。

细粒棘球蚴感染对小鼠炎症性肠病的保护机制研究

目的观察细粒棘球蚴感染对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠炎症性肠病(IBD)症状的保护作用及可能机制。方法建立继发性细粒棘球蚴感染小鼠模型,再给予DSS诱导IBD症状,解剖后ELISA法检测小鼠血清中囊液抗原水平,并观察腹腔内的包囊;根据每日体重监测、解剖后结肠长度测量及结肠组织病理学评分指标评估细粒棘球蚴感染对炎症性肠病的保护作用;采用流式细胞术CBA法检测模型鼠血清中Th1/Th2/Th17水平,评价细胞因子对炎症性肠病的保护作用。结果小鼠感染细粒棘球蚴后血清HCF抗体阳性率与成囊率均为100%。细粒棘球蚴感染减轻了DSS引起的小鼠体重下降程度;结肠变短程度减小,HE染色检查小鼠结肠组织炎性症状显著改善。CBA检测显示细粒棘球蚴感染小鼠血清IL-4、IL-10、IL-17A、IL-6、IFNγ含量均较正常小鼠显著增加,表现为Th2为主的免疫反应;细粒棘球蚴感染合并IBD模型组小鼠Th2/Th1型细胞因子比率同IBD组相比显著升高。结论细粒棘球蚴感染IBD模型小鼠血清IL-4、IL-10水平升高,Th2高水平状态削弱了DSS引发的Th1反应,表明细粒棘球蚴感染可改善IBD小鼠Th1/Th2/Th17细胞因子平衡,IL-4、IL-10可能参与细粒棘球蚴感染对炎症性肠病的保护。

细粒棘球绦虫表面抗原MKK1的生物信息学分析

目的运用生物信息预测网站及相关工具分析细粒棘球绦虫表面抗原MKK1的理化性质、抗原性等。方法EgMKK1氨基酸序列经NCBI数据库中下载,采用ProtParam分析蛋白的理化性质,SignalP-5分析信号肽,Euk-mPLoc 2.0进行亚细胞定位,ProtScale、SOSUI及DNASTAR分析亲疏水性,SOMPA分析二级结构,NetPhos分析磷酸化位点,MotifScan分析修饰位点,Swissmodel分析三级结构,TMHMM分析跨膜区域,ABCpred和IEDB预测B细胞抗原表位,SYFPEITHI预测T细胞抗原表位。结果EgMKK1由338氨基酸序列组成,分子式为C_(1688)H_(2687)N_(471)O_(497)S_(17),亲水指数为-0.167456,为亲水蛋白;无信号肽,含2个跨膜区,且定位于细胞质及细胞核中。二级结构中α螺旋占43.20%,β折叠占10.95%,β转角占4.14%,无规则卷曲占41.72%。EgMKK1能与HLA-A*02-01结合,且能被HLA-DRB*0401(DR4Dw4)分子呈递。结论生物信息学预测EgMKK1为亲水性蛋白,含有丰富的T、B细胞抗原表位,可为该蛋白的生物学功能研究及细粒棘球蚴病的防治研究提供参考。

两型棘球蚴感染早期对肝组织自噬和肝巨噬细胞极化的影响

目的 明确细粒棘球蚴和多房棘球蚴感染早期对小鼠肝脏自噬相关蛋白及巨噬细胞极化的影响。方法 购雌性BALB/C小鼠18只,随机分为实验组与对照组。实验组分别接种细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫原头蚴,感染30 d后解剖小鼠,取肝脏,切片,通过HE染色观察两型棘球蚴感染后小鼠肝脏病理学变化,利用免疫组化法和Western blot检测小鼠肝脏中自噬相关蛋白的表达,采用流式细胞术检测肝脏M1和M2巨噬细胞比例。结果 感染细粒棘球蚴和多房棘球蚴30 d小鼠肝脏病灶面积和病灶数量存在差异,免疫组化检测细粒棘球蚴和多房棘球蚴感染小鼠肝脏自噬相关蛋白LC3、P62相对表达量分别为(7.34±2.33)%、(15.19±8.37)%和(16.09±6.43)%、(11.46±3.81)%,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测显示多房棘球蚴感染组LC3蛋白表达量(1.08±0.20)%显著高于细粒棘球蚴感染组的(0.53±0.29)%(P<0.05)。细粒棘球蚴组和多房棘球蚴组的肝脏巨噬细胞比例为(29.20±8.05)%(26.47±4.58)%,M1型巨噬细胞比例分别为(42.93±20.76)%和(43.93±14.16)%,均显著高于对照组。M2型巨噬细胞比例分别为(9.45±2.61)%和(6.09±0.09)%,显著低于对照组(P<0.05)。结论 细粒棘球蚴和多房棘球蚴早期感染均促进小鼠肝脏自噬相关蛋白的表达,使巨噬细胞向M1型极化,同时抑制M2型极化。自噬可能在早期参与减轻炎症反应,帮助机体清除病原体。

丝氨酸蛋白酶在细粒棘球绦虫中的表达及活性鉴定

目的比较细粒棘球绦虫丝氨酸蛋白酶(EgSP)在原头节、生发层(包囊)和成虫中的表达水平差异及活性鉴定。方法采用TRIzol试剂分别提取细粒棘球绦虫原头节(经胃蛋白酶消化和未经胃蛋白酶消化)、生发层(包囊)和成虫总RNA,并进行PCR分别扩增EgSP基因片段,PCR扩增产物测序后通过Clustal×2.0软件进行序列比对,采用邻接法构建系统进化树。选择具有SP活性基团的38 000亚基基因序列进行原核表达,将正确的目的片段克隆至表达载体pET-30a中,再转化至大肠埃希菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用His标签亲和层析纯化柱纯化重组蛋白EgSP(rEgSP)。将rEgSP(25μg)与等量的弗氏完全佐剂混合乳化,皮下多点注射免疫5只BALB/c小鼠,从第2次免疫开始,改为等量的弗氏不完全佐剂,第4次加强免疫采用腹腔注射,每次免疫间隔1周。免疫结束后,尾静脉采血,分离血清。ELISA检测血清中特异性抗体水平。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定不同阶段中EgSP mRNA的相对表达水平。蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测细粒棘球绦虫不同阶段中EgSP的表达情况,采用Image Lab 6.0软件分析蛋白质的表达丰度。免疫组化检测EgSP在细粒棘球绦虫原头节和生发层(包囊)中的表达情况。纯化的rEgSP和囊液蛋白用胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸酶底物(Z-Arg-AMC)、组织蛋白酶L底物(Z-Phe-Arg-AMC)测定其蛋白酶活性。采用Graphpad Prism 7统计学软件对多组数据进行单因素ANOVA方差分析。结果细粒棘球绦虫原头节、生发层(包囊)和成虫的cDNA中均扩增出目的片段,与预期大小(1 455 bp)相符。PCR产物测序结果显示,EgSP开放阅读框为1 455 bp,编码484个氨基酸,相对分子质量(Mr)为54 870,与多房棘球绦虫丝氨酸蛋白酶(Em SP)核苷酸序列一致性为97.73%,氨基酸序列一致性为96.69%。系统进化树分析结果显示,与其他绦虫属氨基酸序列一致性为33.10%~87.19%,其中与亚洲带绦虫(GenBank登录号:VDK43949.1),带状泡尾绦虫(GenBank登录号:VDM30859.1)的氨基酸序列一致性分别为87.19%、52.89%。qRT-PCR结果显示,胃蛋白酶消化的原头节、生发层(包囊)、成虫中EgSP mRNA的相对转录水平分别为2.1±1.2、9.1±2.1、5.8±2.3,均高于未经胃蛋白酶消化的原头节(1.0±0)(P<0.01)。Western blotting分析结果显示,原头节、生发层(包囊)、成虫中EgSP蛋白相对表达水平分别为1.2±0.1, 3.6±0.2, 4.0±0.1,生发层(包囊)和成虫中的表达水平高于原头节(P<0.01)。免疫组化分析结果显示,EgSP多克隆抗体能够特异性在生发层(包囊)中表达,而在原头节中不表达。在3种不同pH缓冲液中,rEgSP和囊液蛋白均具有蛋白酶活性,且在pH7.2的缓冲液中,rEgSP和囊液蛋白丝氨酸蛋白酶活性最强(P<0.01)。结论EgSP在细粒棘球绦虫生发层(包囊)和成虫组织中高表达,原头节中表达较低。rEgSP和囊液蛋白均具有较强的丝氨酸蛋白酶活性。

咔唑氨基醇化合物H1402对棘球蚴感染小鼠组织淋巴细胞及其亚群的影响

目的 分析咔唑氨基醇化合物H1402对棘球蚴感染小鼠的淋巴细胞及其亚群的影响。方法 分别采集细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫原头蚴,经肝门静脉接种建立感染小鼠模型。建模60 d后,分别用低剂量(50 mg/kg)和高剂量(80mg/kg)H1402每天灌胃干预两种棘球蚴病小鼠30 d。灌胃结束4周后留存肝组织观察病理变化,分离肝脏、脾脏和血液淋巴细胞,用流式细胞术检测小鼠组织淋巴细胞。结果 H1402治疗后棘球蚴感染小鼠肝脏病灶大小和数量减少,病理结果显示炎症反应减弱(P<0.05)。多房棘球蚴感染治疗组中,H1402高剂量组肝B细胞比例(24.35±7.46)%明显高于感染模型组(17.74±4.57)%(P<0.05);肝脏T细胞(1.15±1.14)%,包括Treg,CD4^(+)T,CD8^(+)T和活化的T细胞比例H1402高剂量组明显低于低剂量组(36.00±5.68)%(P<0.05)。脾脏T细胞比例H1402高剂量组(22.86±12.49)%显著低于低剂量组(46.29±7.22)%和感染模型组(42.16±7.44)%(P<0.05)。在血液中活化的T细胞比例,尤其是CD8^(+)T细胞比例H1402高剂量组(16.62±5.72)%显著低于低剂量组(34.63±5.06)%(P<0.05);B细胞比例尤其是活化的B细胞H1402低剂量组(0.32±0.06)%显著低于感染模型组(0.74±0.21)%(P<0.05)。细粒棘球蚴感染小鼠,肝脏T细胞,包括Treg和CD8^(+)T细胞均明显高于空白组,CD8^(+)T细胞比例H1402高剂量组(40.54±7.22)%显著高于模型组(9.88±5.93)%(P<0.05)。脾脏T细胞比例尤其是活化的T细胞均明显低于空白组(P<0.05)。血液淋巴细胞CD4^(+)T细胞比例H1402高剂量组(31.59±27.94)%显著降低(P<0.05)。结论 H1402对棘球蚴感染治疗有效,明显降低多房棘球蚴和细粒棘球蚴感染肝脏和脾脏的T细胞比例,多房棘球蚴感染小鼠药物干预后活化的CD4^(+)T细胞和活化的CD8^(+)T细胞比例上升,可能参与免疫调节,抑制多房棘球蚴的病理反应。

细粒棘球绦虫表面抗原EpC1的生物信息学分析

目的采用生物信息学方法分析细粒棘球绦虫表面抗原EpC1的结构和功能等。方法从NCBI数据库中下载EpC1氨基酸序列,采用ProtParam预测蛋白的理化性质,SignalP-5预测信号肽,Euk-mPLoc 2.0进行亚细胞定位,ProtScale、SOSUI、DNASTAR预测其亲疏水性,SOMPA预测二级结构,NetPhos预测磷酸化位点,MotifScan预测修饰位点,Swissmodel预测三级结构,TMHMM分析跨膜区域;运用ABCpred、IEDB预测B细胞抗原表位,SYFPEITHI预测T细胞抗原表位。结果预测EpC1由174氨基酸序列组成,分子式为C_(884)H_(1403)N_(245)O_(268)S_(9),不稳定指数为46.27,为亲水蛋白,无信号肽和无跨膜区,且定位于细胞膜及细胞质中。二级结构中α螺旋占44.25%,β折叠占14.94%,β转角占5.75%,无规则卷曲占35.06%,EgEpC1具有能与HLA-A*02-01的结合能力,且能被HLA-DRB*0401(DR4Dw4)分子呈递。结论生物信息技术分析EpC1蛋白存在多个B、T细胞表位,含有钙结合结构域,可为该蛋白的基因克隆表达及细粒棘球绦虫感染的防治研究提供理论基础。

两种棘球绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂结构及功能的比较与分析

目的比较并分析细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)和多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis,Em)不同时期高表达的两种丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor,简称Serpin)基因和编码蛋白的结构及功能。方法用NCBI-BLAST、ExPasy、TMHMM 2.0 Server、Signal 5.0 Server、PROSITE、Coils Server、SMART、SWISSMODEL、ElliPro等在线生物信息学网站及软件,对Eg和Em两种Serpin的同源性进行分析,并预测相应蛋白的基本理化性质、跨膜区、motif位点、功能域、二级和三级结构、细胞抗原表位等。结果 SerpinA在Eg和Em的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94.02%和92.92%;SerpinB均为100%;SerpinA为稳定的亲水性蛋白,SerpinB为稳定的疏水性蛋白,均为非膜蛋白,在N-末端均有1个信号肽,且均为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员;Eg-SerpinA、EmSerpinA和Eg(Em)-SerpinB二级结构α螺旋分别为47.96%、49.44%和36.00%,β折叠分别为15.80%、14.12%和17.33%,无规则卷曲分别为29.97%、31.36%和38.67%;Eg和Em Serpin A三级预测结构较接近;B淋巴细胞抗原表位预测结果显示,Eg-SerpinA和Em-SerpinA共有最佳线性表位候选区域为RCMPAPPVDFFVDHPFIFFIVTKTGIPVFMGHVVHP(316~351),Eg-SerpinB和Em-SerpinB则为NQETGQ(42~47);Eg-SerpinA与Em-SerpinA的最佳构象表位相同,为F334、I335、V336、T337、K338、T339、G340、I341、P342和V343;Eg(Em)-SerpinB则为N42、E44、T45、G46和Q47。T淋巴细胞抗原表位预测结果显示,Eg-SerpinA的T细胞最佳HLAⅠ类分子抗原表位为SPLSVYSAL(2~10),Em-SerpinA的最佳HLAⅡ类分子抗原表位为MPAPPVDFF(318~326);Eg(Em)-SerpinB的最佳HLAⅠ类分子抗原表位为VVISYSEAR(11~19)。结论两种棘球绦虫分泌的Serpin在虫体对宿主入侵、发育过程及对感染病灶的免疫损伤方面可能发挥了重要作用,对Serpin的研究有望应用于棘球绦虫病的诊断、药物治疗及疫苗研制领域。

多房棘球绦虫丝氨酸蛋白酶基因的克隆、表达及抗原性鉴定

目的克隆多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis,Em)丝氨酸蛋白酶(SP)基因,通过原核系统表达Em-SP并对其抗原性进行鉴定。方法PCR扩增获得Em-SP片段;构建重组质粒pET30a-Em-SP,NdeI/HindIII双酶切并测序,将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)菌株中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用SDS-PAGE电泳分析表达蛋白的分子质量单位和表达丰度。表达产物经亲和层析(Ni-IDA树脂)纯化后采用Western blot鉴定蛋白的反应原性。结果PCR扩增SP基因片段为1374 bp,重组质粒pET30a-Em-SP酶切后电泳和测序表明阅读框架序列与设计一致。IPTG诱导重组质粒转化菌表达蛋白主要以包涵体形式存在,表达蛋白的相对分子质量约为51×103,与预期值大小相符,且能被鼠抗His-Tag抗体识别,用包虫患者血清Western blot鉴定呈阳性。结论克隆的Em-SP基因在原核中成功表达,表达产物具有良好的反应原性,可作为诊断试剂的候选抗原。