利用亮甲酚蓝染色筛选优质猪卵母细胞

目的利用亮甲酚蓝（BCB）染色提高猪体外胚胎培养体系的效率。方法对猪卵丘卵母细胞复合体（COCs）进行BCB染色,观察染色后猪卵母细胞成熟率和早期胚胎发育能力并进行分析。结果着色组（BCB＋）猪卵母细胞达到减数分裂Ⅱ（MⅡ）期的比率（91.6%）显著高于未着色组（BCB-）（64.0%）和对照组猪卵母细胞（77.5%）（P〈0.05）;BCB＋孤雌猪胚胎的囊胚率（34.9%）显著高于BCB-（9.5%）和对照组（23.1%）（P〈0.05）;BCB＋核移植猪胚胎的囊胚率（23.0%）显著高于BCB-（5.0%）和对照组（14.1%）（P〈0.05）。结论BCB染色是一种有效筛选具有较强发育能力猪卵母细胞的方法。

利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白转基因猪胚胎的研究

试验对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选,以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,并对重构胚在体外发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究。结果显示,采用4.0μg.mL-1脂质体转染试剂,1.6μg.mL-1质粒DNA,转染6 h可以获得最佳转染效果,转染效率达4.48%;GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为10%,GFP阳性胚胎率为48%。结果表明,脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞,获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能。

猪精液颗粒冷冻技术的研究

为提高猪冻精质量,加速猪冻精在生产上的应用,本试验以解冻后的精子活率、顶体完整率和体外受精(IVF)结果作为判定指标,探讨了冷源和Equex.STM对猪精液颗粒冷冻效果的影响。手握法采集成年、健康种公猪精液,分别采用含有Equex.STM的稀释液和普通稀释液进行两步法稀释,然后以干冰或液氮为冷源进行精液冷冻。结果表明,以干冰为冷源滴冻精液冻后活率为0.487833±0.046761,顶体完整率为0.782±0.039704,而以液氮为冷源的方法冻后活率为0.3334±0.055734、顶体完整率为0.5578±0.068482,前者在这两项指标上均显著优于后者(P<0.05)。另外,在稀释液中添加Equex.STM,以干冰为冷源进行滴冻,可使冻精顶体完整率极显著提高(P<0.01)。以含有Equex.STM的稀释液采用干冰滴冻的冻精进行IVF,胚胎卵裂率、囊胚率分别为0.5316±0.125582和0.216±0.053198。结果表明,采用Equex.STM作为冷冻保护剂并以干冰作为冷源可以获得高质量的猪冷冻精子。

猪卵母细胞c-mos基因表达以及RNA干扰

c-mos基因在动物卵母细胞减数分裂调控中起作用,但其作用机制目前仍不清楚。本实验通过RT-PCR、免疫荧光激光共聚焦检测方法检测了猪卵母细胞在体外成熟培养过程中c-mos基因在转录水平、翻译水平上的表达以及蛋白的分布,并应用注射小干扰RNA(siRNA)方法对其进行了RNA干扰(RNAi)研究。结果显示,猪卵母细胞在体外成熟培养过程中c-mos基因mRNA量逐渐增高,电激活后6h接近完全降解;MOS(c-mos基因蛋白产物)在GV卵母细胞生发泡中有一定量的表达,生发泡破裂(GVBD)前表达量增加且开始向卵母细胞胞质弥散,成熟培养44h未成熟卵母细胞中的MOS表达量要高于成熟卵母细胞,激活后6h核区MOS明显减少,但仍然有少量MOS分布于胞质中;成熟培养前干扰c-mos基因,所用三个siRNA都能成功敲低mRNA量,分别是同时期对照组mRNA量的0.08±0.03,0.11±0.06和0.20±0.06倍,干扰后虽然没有完全剔除MOS,但MOS量比同期卵母细胞有明显下降,仍可以引发成熟卵母细胞染色体解凝集。研究结果揭示了猪卵母细胞体外成熟及发育进程中c-mos基因在转录和翻译水平上的动态表达规律,建立了猪卵母细胞c-mos基因RNAi体系,为MOS在猪卵母细胞发育过程中的功能研究建立了重要的基础。

全细胞胞质内注射法生产猪重构胚的研究(简报)

自从1997年克隆羊“Dolly”出生以来。体细胞核移植技术得到广泛应用,已经有十余种克隆哺乳动物出生，但克隆效率仍然很低。核移植方法的不够完善是其重要原因之一。传统的核移植方法——电融合法和胞质内注射法虽然都取得了成功。但还存在操作复杂及需要辅助设备等问题。为了能够找出一种既容易操作，又不需要特殊设备的核移植方法，本研究对胞质内注射技术进行了改进,尝试了一种新的核移植方法——非Piezo辅助的全细胞胞质内注射法，即不通过Piezo辅助。不破坏供体细胞膜直接将供体细胞注入卵母细胞内，并且比较了这种方法与电融合法对猪体细胞核移植效率的影响。探讨了非Piezo辅助的全细胞胞质内注射法在猪体细胞核移植上的可行性。

猪骨髓间充质干细胞的分离培养及核移植后重构胚胎发育能力的研究

不同类型的细胞核移植效率不同,原因之一可能是不同类型细胞核移植后进行重编程的潜力不同。本实验对猪骨髓间充质干细胞(porcine bone marrow mesenchymal stem cells,pMSCs)体外分离培养的方法进行了优化,对猪骨髓间充质干细胞的增殖及生长特性进行了观察分析,并以其作为供体细胞进行核移植,对此类型细胞进行重编程的潜力进行了评估。结果表明用密度梯度离心法分离猪骨髓间充质干细胞优于全骨髓贴壁法;猪骨髓间充质干细胞数目在培养第6天达到峰值,传代培养10h时,贴壁率达到78.50%;传代培养后第4天分裂指数最高,为24.00‰;以猪骨髓间充质干细胞(pMSCs)和猪胎儿成纤维细胞(PF)分别作为供核细胞构建核移植胚胎,其体外囊胚发育率分别为14.63%与15.07%(P>0.05),孤雌对照组囊胚发育率为30.91%(P<0.05);而三组囊胚细胞数分别为30.67±17.7、24.1±6.5和25.8±11.4(P>0.05)。实验表明,体外培养的猪骨髓间充质干细胞生长增殖旺盛,生物学性状稳定,并适合作为核移植供体细胞。

环状RNA的功能以及调控动脉粥样硬化发生发展的研究进展

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是由多种原因引起的心血管疾病,包括高血压、糖尿病、高血脂症和吸烟等。AS对人类有极大的危害,由AS引发的心血管疾病已对人类健康构成了严重威胁。AS的发生可引起血管壁损伤和炎症反应,其原因可能是血管平滑肌细胞和内皮细胞的凋亡、坏死以及巨噬细胞的分化等。近年来,许多研究发现环状RNA(circular RNA,circRNA)在AS的发生和发展中起着关键的调节作用。因此,本文对circRNA调控AS的最新研究进行了综述。

miRNA在胆固醇逆向转运中的作用研究进展

胆固醇逆向转运(RCT)是体内清除胆固醇的唯一机制,对维持体内胆固醇稳态具有积极意义。miRNA是具有转录后调节基因表达能力的非编码RNA。现已在人体中鉴定出数百种miRNA,它们几乎参与所有过程的调节,包括胆固醇转运、新陈代谢和维持胆固醇稳态。由于它们的尺寸较小,并且能够特异性调节基因表达,因此miRNA逐渐成为调节血脂异常和其他脂质相关疾病的靶标。本文概述了可调节RCT的miRNA,主要包括miR-33、miR-19b、miR-144-3p、miR-223、miR-378等,重点介绍这些miRNA调节胆固醇代谢的机制,为防治动脉粥样硬化提供新思路。

环状RNA在心血管疾病中的研究现状

随着全基因组分析和RNA测序技术的进步,多种非编码RNA逐渐成为研究热点。环状RNA(circRNA)具有多种细胞功能,其表达的改变与多种病理生理过程及疾病的发生发展相关。circRNA已被证明是心血管疾病方面的重要调节因子,如高血压、动脉粥样硬化、急性心肌梗死、心力衰竭、心脏纤维化等。因此,circRNA有望成为心血管疾病的潜在治疗靶点和生物标志物。在这篇综述中,我们以circRNA的生物学机制为基础,综述了目前有关circRNA作为心血管疾病调节因子和生物标志物的研究进展。

转基因兔与克隆兔高效胚胎移植体系的建立

目的建立高效的转基因兔和克隆兔的胚胎移植实验技术平台。方法通过外科手术移植的方法将受精胚胎、转基因胚胎和体细胞核移植胚胎分别移植到同步发情或异步发情的受体兔输卵管。结果移植受精胚胎、转基因胚胎和体细胞核移植胚胎的受体兔怀孕率分别为100％、66．67％、36.36％，产仔数分别为19、24及17只，仔兔的成活率分别为90.48％、92．31％、17．65％。出生仔兔与移植胚胎数的比率分别为43．75％、21．31％、8．54％。结论成功建立了高效的转基因兔和克隆兔的胚胎移植的实验技术平台。

微针疗法分阶管理新方法的有效性探索

目的:评估在微针疗法的皮肤微通道开启前后应用复合酸抑菌凝露联合谷胱甘肽与沉香纯露修复敷料进行相应处理的应用效果。方法:选取2021年5月-2022年2月哈尔滨市第二医院皮肤科和激光美容科就诊的面部色素沉着患者60例作为研究对象,按照随机数表法分为对照组和治疗组,各30例。对照组给予微针导入谷胱甘肽,术后使用含沉香纯露的医用皮肤修复敷料,治疗组给予微针术前应用复合酸抑菌凝露进行皮肤预处理,微针导入谷胱甘肽,术后使用含沉香纯露的医用皮肤修复敷料。比较两组患者的临床疗效与皮肤屏障指标的角质层含水量、经表皮水分流失量、弹性指数、红斑指数和黑色素值。结果:治疗组总有效率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后,治疗组患者角质层含水量和弹性指数高于对照组;治疗组患者经表皮水分流失量、红斑指数与黑色素值低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:微针导入谷胱甘肽前应用复合酸抑菌凝露进行皮肤预处理,术后应用沉香纯露修复敷料作为皮肤微通道分阶管理的新治疗手段,对皮肤色素沉着的临床疗效显著,可以有效改善皮肤屏障指标水平,减轻黑色素值。

TLR2鉴定为一种新型的银屑病免疫相关生物标志物

目的探讨Toll样受体2(Toll-like receptors 2,TLR2)在银屑病中的作用与机制。方法分析TLR2在3个银屑病相关的GEO数据集中的表达并鉴定出差异表达的TLR2相关基因(differently expressed TLR2-related genes,DETRGs)。应用功能富集分析对其潜在机制进行探索。通过SVM-RFE分析和LASSO回归模型缩小TLR相关基因的预测范围并建立诊断模型。采用“CIBERSORT”测定银屑病患者22种免疫细胞组分的组成特征。结果经生物信息学分析发现,TLR2在银屑病中高表达并确认969个TLR2相关基因。其中141个基因显著上调,36个基因显著下调。通过KEGG通路分析表明,显著富集的通路有甲型流感、丙型肝炎、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用、IL-17信号通路和NOD样受体信号通路。利用机器学习结果确定IL36G、PDZK1IP1和RHCG为银屑病TLR2相关的关键诊断基因,ROC分析也确认了这些基因。对健康人和银屑病患者的样本进行了RT-qPCR检测,进一步证实了这3个基因作为诊断标记的可能性。免疫细胞浸润分析表明,IL36G、PDZK1IP1和RHCG与CD4记忆T细胞、T滤泡辅助细胞和γδT细胞呈显著正相关,与树突细胞、肥大细胞和NK细胞呈显著负相关。结论TLR2可以作为预测银屑病诊断和疾病活性的免疫相关生物标志物。

体细胞核移植生产绿色荧光蛋白转基因猪

体细胞核移植转基因动物制作路线是目前生产转基因家畜的最佳方法.绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)转基因猪研究可以为转基因家猪育种、人类疾病模型和人类异种器官移植研究奠定良好的基础.本研究对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选,以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体,构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,并对重构胚在体外和体内发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究.结果显示,采用4.0μL/mL脂质体转染试剂,1.6μg/mL质粒DNA,转染6h可以获得最佳的转染效果,转染效率达3.61%;GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为10%,GFP阳性胚胎率为48%;重构胚移植于10头受体后,有5头妊娠,3头受体发育到期,共出生克隆猪6头,其中4头为GFP阳性,经DNA检测确认为GFP转基因猪;转基因克隆胚胎移植出生率为1.0%,阳性个体出生率为0.7%.结果表明,脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞,获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能.本研究对我国体细胞克隆转基因猪的研究具有重要的参考价值.

体细胞核移植克隆民猪:培养液对卵母细胞成熟及胚胎发育的影响

体外培养成熟的卵母细胞是进行克隆猪研究所需受体卵母细胞的主要来源,卵母细胞成熟质量与体细胞核移植胚胎发育能力关系密切.为提高卵母细胞体外成熟率和成熟质量,进而提高体细胞核移植猪的成功率,本实验以改进的TCM199培养液为基础液(T),分别添加10%的猪卵泡液(T+pFF)和10%的胎牛血清(T+FBS)后进行卵母细胞成熟培养,以成熟率和体细胞核移植胚胎发育率等重要指标为标准,研究了pFF和FBS对卵母细胞成熟及核移植胚胎发育能力的影响.T,T+pFF和T+FBS组在成熟培养后42h卵母细胞成熟率分别为(53.2±3.8)%,(69.7±3.8)%和(70.2±3.7)%,添加10%的pFF和FBS显著(P<0.05)提高了卵母细胞成熟率;3组不同成熟培养液获得的成熟卵母细胞在体细胞核移植后囊胚发育率差异不显著,但T+pFF组的囊胚细胞数(34.5±2.24)显著(P<0.05)高于T组的囊胚细胞数(26.6±1.25).来自T+pFF组的体细胞核移植胚胎经手术法移植入发情周期为第0天或第1天的18头受体母猪输卵管,其中有3头受体母猪妊娠发育到期,获得克隆民猪14头,其中有6头健康成活至今.实验结果表明,培养液中添加10%pFF可以有效提高卵母细胞成熟比例和成熟质量,在含有10%pFF培养液中获得的成熟卵母细胞具有支持核移植胚胎全程发育的能力.

小鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养及鉴定

目的：建立分离培养小鼠原代主动脉血管平滑肌细胞（VSMC）的方法并检测其生长特性。方法：剥离小鼠主动脉中膜层,分别采用组织块培养法及胶原酶消化法分离培养小鼠主动脉来源的原代VSMC,免疫荧光法检测细胞的纯度和分化状态;3-（4,5-二甲基-2-噻唑）-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝（MTT）法测定小鼠主动脉VSMC传代细胞的生长、增殖特性。结果：组织块培养法培养组织块8d后,细胞从组织块边缘爬出,18 d后细胞汇合度达到80%以上后传代;胶原酶消化法分离培养的细胞生长7 d后,汇合度可达80%,此时进行传代;2种方法获得的细胞进行免疫荧光染色,结果显示细胞传至第3代时纯度在95%以上,传至第8代时分化状态并没有改变;MTT法显示细胞生长3~5 d时处于指数生长期。结论：本研究建立了2种可靠稳定的分离和培养小鼠主动脉VSMC的方法,VSMC纯度高,多次传代后细胞特征稳定。

小半夏加茯苓汤对小鼠移植心存活时间的延长效果研究

目的:探讨小半夏加茯苓汤对小鼠心脏移植模型中移植心存活时间的延长效果及作用机制。方法:将接受过腹腔心脏移植手术的小鼠分为实验组和对照组,自移植手术当日起至术后7天,每日经口给药,通过腹部触诊判断移植心脏跳动情况,移植术后30日,取部分小鼠移植心脏进行病理检查,取脾细胞进行淋巴细胞培养,并检测培养液中白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-10和干扰素(IFN)-γ的浓度。取移植心脏存活时间超过30天的小鼠脾脏,通过流式细胞术检测调节性T细胞(Regulatory Tcells,Tregs)的含量。结果:与对照组相比,实验组的移植心存活时间明显延长(P<0.01),心脏病理切片结果提示实验组的心脏血管病变受到了抑制,脾细胞培养液中IL-2和IFN-γ浓度明显降低,而IL-4和IL-10的浓度升高,脾细胞CD4阳性细胞中CD25和Foxp3均阳性的细胞含量明显高于对照组中同类细胞含量。结论:小半夏加茯苓汤可以显著延长小鼠移植心脏的存活时间,可能与其诱导调节T细胞的产生、改变受体小鼠体内Th-1和Th-2细胞因子的平衡及抑制IL-2、IFN-γ减轻心脏损伤有关。