1株猪鼻支原体特异性单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备与鉴定猪鼻支原体单克隆抗体,用于猪鼻支原体诊断及致病机理的研究。方法将猪鼻支原体全菌蛋白免疫小鼠,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体。鉴定其抗体亚型并对纯化单抗的效价、特异性进行鉴定。将该单抗用于菌落免疫杂交试验、间接免疫荧光试验。结果获得了1株猪鼻支原体单抗,命名为Mhr-08。该单抗的亚型属于IgG1,轻链为κ型。ELISA测定该纯化单抗效价为1∶102 400,Western-blot检测结果表明,该单抗与猪鼻支原体全菌蛋白在43kDa处出现特异性反应条带,与猪其他支原体、大肠杆菌及KM2培养基无交叉反应;该单抗为猪鼻支原体表面膜蛋白抗体,可成功应用于菌落免疫杂交试验;将其用于间接免疫荧光试验可成功检测出黏附于猪气管上皮细胞上的猪鼻支原体。结论成功制备和鉴定出1株猪鼻支原体单克隆抗体,该特异性单抗的获得为猪鼻支原体的诊断及致病机理的研究提供了工具。

免疫胶体金技术检测猪繁殖与呼吸综合征

采用斑点胶体金技术建立一种快速、简便、准确检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法。运用RT-PCR技术克隆出PRRSV核衣壳蛋白基因,经原核表达与蛋白纯化获得重组的核衣壳蛋白,作为诊断抗原。采用柠檬酸三钠还原法制备了直径为18~20 nm的胶体金,对兔抗猪Ig G抗体进行标记后,进一步组装成斑点胶体金免疫检测试剂。经猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)阴性和阳性血清检测,斑点胶体金免疫检测试剂仅与阳性血清发生反应,特异性强,反应30~40 min内就可以在硝酸纤维膜上出现清晰的红色斑点,其灵敏度和Dot-ELISA法相仿。该检测方法可广泛应用于PRRS的临床诊断和流行病学调查,也可作为研究兽医快速诊断的技术基础。

2011—2017年浙江省猪病毒性腹泻病的流行病学调查

为了解浙江省不同地区猪群中猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（Po RV）和猪Delta冠状病毒（PDCo V）导致猪病毒性腹泻的感染情况,本研究应用RT-PCR方法对2011—2017年收集的浙江省不同地区猪腹泻样品进行4种病毒的检测与分析。结果显示,2011年至今,PEDV阳性率为71.25%,TGEV阳性率为3.05%,Po RV阳性率为17.67%,PDCo V阳性率为8.75%;单独感染中PEDV阳性率为51.89%,TGEV阳性率为0.94%,Po RV阳性率为5.19%,PDCo V阳性率为4.25%;混合感染中PEDV/TGEV阳性率为2.4%,PEDV/Po RV阳性率为15.1%,PEDV/PDCo V阳性率为2.8%,Po RV/PDCo V阳性率为0.5%,PEDV/TGEV/PDCo V阳性率为0.5%。结果表明,浙江省不同地区存在这4种病毒所导致的猪病毒性腹泻病,其中在单独感染中以PEDV感染为主,混合感染中以PEDV/Po RV二重混合感染为主。不同年份中以PEDV感染最为严重,阳性率均在50%以上;Po RV感染在2015年上半年阳性率高达60.9%,其余年份均稳定在20%左右;TGEV每年均有零星发病;PDCo V在2016年感染最为严重,阳性率为22.9%。该结果为浙江省猪病毒性腹泻病的诊断和防控积累了资料。

猪肺炎支原体抗原定量ELISA检测方法的建立

为建立猪肺炎支原体抗原的快速检测方法,本研究以抗猪肺炎支原体P46蛋白单克隆抗体为包被抗体,抗P46蛋白多克隆抗体为检测抗体,建立了猪肺炎支原体双抗体夹心ELISA方法。通过优化后的反应条件为:抗猪肺炎支原体P46蛋白单克隆抗体包被浓度为2.5μg/mL,抗P46蛋白多抗及酶标二抗稀释度分别为1∶40 000和1∶10 000。该ELISA的重复性变异系数小于10%,最低检出量为9.754 ng/mL,与猪鼻支原体、猪滑液支原体、絮状支原体等无交叉反应。使用该ELISA方法对人工稀释的培养物中抗原含量进行检测,通过单点法和对样品倍比稀释后进行双平行线拟合两种方法计算,得出两种计算方法结果均与真实值基本相符,但双平行线法检测比单点法检测更加稳定。本研究建立的双抗体夹心ELISA方法为猪肺炎支原体的定量检测提供了有效手段,可用于猪支原体肺炎灭活疫苗生产过程中抗原的检测,为灭活疫苗生产中的质量控制提供了便利。

猪肺炎支原体抗体胶体金免疫层析检测方法的建立

旨在建立猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）抗体胶体金免疫层析检测方法,从而快速地对Mhp的感染和免疫情况进行监测,预防和控制猪支原体肺炎传播。通过柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,确定Mhp特异性抗原P46蛋白的最适标记pH和标记浓度并进行标记,作为金标液。将P46蛋白包被检测线T线,抗P46蛋白单抗包被质控线C线,组装检测试纸条。经优化,建立可同时用于Mhp血清抗体和黏膜抗体检测的胶体金免疫层析检测方法。利用该检测方法对76份临床血清样品和40份临床鼻拭子样品进行检测,并与ELISA检测结果进行比较。用该试纸条检测血清样品时,灵敏性、特异性、重复性较好,与商品化Mhp ELISA抗体检测试剂盒符合率为96.1%;该方法检测呼吸道鼻拭子样品时,存在微弱的非特异性反应,检测结果与本实验室建立的sIgAELISA检测方法符合率为87.5%。本研究成功建立了Mhp抗体胶体金免疫层析检测方法,整个过程只需10 min。检测血清样品具有较好的特异性和灵敏性,检测鼻拭子样品时特异性还有待提高。