无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒条件的优化

目的优化无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒的条件,为Vero细胞流感疫苗的开发奠定基础。方法在搅拌瓶中采用不同的细胞接种量和不同的微载体浓度培养Vero细胞,制备流感病毒,并检测不同的pH值、TPCK-胰酶含量、病毒接种量及病毒收获时间对流感病毒血凝滴度的影响。结果以(1.0～5.0)×105个/ml的Vero细胞接种至浓度为3mg/ml的无血清微载体中,病毒培养液pH值为7.2～7.4,TPCK-胰酶含量为1.0μg/ml,病毒接种量为1.0MOI,并在感染48h后补加TPCK-胰酶,培养72h后收获上清与细胞内病毒,血凝滴度可达1:512。结论已获得了无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒的适宜条件,为应用生物反应器大规模制备流感病毒奠定了基础。

培干扰素α1b原液中残留DNA定量PCR检测法的验证

目的验证聚乙二醇修饰的干扰素(培干扰素)α1b原液中残留DNA检测的实时荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)。方法提取4批培干扰素α1b原液的残留DNA,使用qPCR检测试剂盒进行扩增反应,绘制标准曲线,建立残留DNA的qPCR检测方法,对建立的方法进行线性、重复性、准确性、精密度、定量限和耐用性的验证,并与探针杂交法进行比较。结果qPCR检测在300 pg/μl~30 fg/μl浓度范围内线性关系良好。6次检测相对标准偏差为7.45%;加标回收率为95.67%~129.28%;不同人员检测相对标准偏差小于30%;定量限为30 fg/μl。不同孵育温度条件下检测结果无明显差异,耐用性良好。探针杂交法与qPCR的检测结果均小于中国药典2020年版规定的10 ng/剂。结论qPCR检测培干扰素α1b原液中DNA残留具有良好的线性、重复性、准确性、精密度和耐用性,适用于该项检测。

胰高血糖素样肽-1衍生物的聚乙二醇定点修饰及其产物性质分析

目的用马来酰亚胺活化的相对分子质量40000的聚乙二醇(MAL-PEG40K)定点修饰胰高血糖素样肽-1衍生物(glucagon like peptide-1analogue,GLP-1a),并分析修饰产物部分性质。方法采用MAL-PEG40K定点修饰GLP-1a,强阳离子交换层析分离纯化修饰混合物,SDS-PAGE及反相高压液相色谱法(RP-HPLC)检测修饰产物MAL-PEG40KGLP-1a纯度,报告基因法检测其体外活性,动物急性降血糖试验检测其体内生物学活性。结果MAL-PEG40K-GLP-1a经SDS-PAGE及RP-HPLC分析,纯度分别为95%和98.1%,体外活性保留率为22.9%,体内具有显著降血糖作用且药效时间明显延长。结论制备的MAL-PEG40K-GLP-1a药学性质获得显著改善,有望开发为安全、长效的新型GLP-1受体激动剂。

聚乙二醇化胰高血糖素样肽1类似物生物活性的报告基因法测定

目的建立检测聚乙二醇化胰高血糖素样肽1类似物(polyethylene glycolylated glucagon-like peptide-1 analogue,PEG-GLP-1a)生物活性的报告基因法,并对该方法进行验证。方法将人胰高血糖素样肽1受体表达载体和分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase,SEAP)报告基因载体瞬时共转染HEK293T细胞,培养后加入PEG-GLP-1a刺激细胞分泌SEAP,使用SEAP报告基因检测试剂盒进行测定,并验证其专属性、准确性、精密度、稳定性等指标。结果人胰高血糖素样肽1受体和SEAP双载体瞬时共转染的HEK293T细胞对PEG-GLP-1a具有强反应性。使用该方法测定PEG-GLP-1a具有良好的专属性。加标回收率为97.6%~102.2%,准确性较好。不同测定日期的日内半数效应浓度的变异系数均不超过10.22%,不同测定日期的日间半数效应浓度的变异系数均不超过13.02%。结论报告基因法可以用于PEG-GLP-1a的生物活性检测。

聚乙二醇修饰胰高血糖素样肽1类似物反应条件的响应面法优化

目的用响应面法对马来酰亚胺活化相对分子质量40000的聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)(MAL-PEG40K)修饰胰高血糖素样肽1类似物(glucagon-like peptide 1 analog,GLP-1a)的反应条件进行优化。方法对GLP-1a浓度、GLP-1a/MAL-PEG40K摩尔比、反应液pH值、反应温度、反应时长进行单因素试验。以前3个条件为自变量,PEG修饰率为响应值,根据中心组合试验设计原理,研究各自变量及其交互作用对PEG修饰率的影响。通过高效液相色谱法分析PEG修饰率,依据回归分析确定各反应条件的最优值。结果GLP-1a与MAL-PEG40K的最佳反应条件为:GLP-1a浓度2.5 mg/ml,GLP-1a/MAL-PEG40K摩尔比1∶1.25,反应液pH8,反应温度4℃,反应时长60 min。该优化条件下,GLP-1a的PEG修饰率可达91.0%。结论响应面法获得了GLP-1a与MAL-PEG40K的最佳反应条件。

重组水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E病毒样颗粒在毕赤酵母中的表达与鉴定

目的在毕赤酵母细胞中稳定表达经连接肽连接的HBsAg和水痘-带状疱疹病毒糖蛋白(glycoprotein,g)E的重组蛋白,并进行初步纯化及颗粒性验证。方法构建HBsAg-gE的四拷贝重组表达质粒,经酶切线性化后电转化至毕赤酵母KM71细胞中,甲醇诱导表达。采用免疫印迹法和ELISA检测表达的重组蛋白,经蔗糖密度梯度离心和凝胶排阻层析初步纯化后进行透射电子显微镜观察。结果HBsAg-gE四拷贝重组质粒经双酶切鉴定正确。表达的重组蛋白经免疫印迹法检测,可以与小鼠抗gE单克隆抗体及抗HBsAg多克隆抗体特异性结合,相对分子质量约90000。经ELISA检测HBsAg呈阳性。蔗糖密度梯度离心后,重组蛋白聚集在40%至55%区带之间,在透射电子显微镜下观察到直径约20 nm左右的病毒样颗粒结构。结论成功在毕赤酵母中表达了HBsAg-gE病毒样颗粒,为在酵母系统中表达水痘-带状疱疹重组疫苗奠定了基础。

微孔板酶底物检测尿酸酶活性方法的建立及验证

目的建立石英微孔板法酶底物检测尿酸酶活性的方法,并对方法进行验证。方法摸索尿酸浓度与吸光度之间的线性关系,找到合适的范围,并验证方法的专属性、线性、重复性、中间精密度、准确性和耐用性。尿酸酶加入固定浓度尿酸溶液,酶促反应5 min后,通过酶标仪检测A_(292 nm)值变化计算尿酸的含量,根据单位时间内尿酸减少量计算出尿酸酶的活性。结果专属性验证结果显示,空白对照尿酸浓度未检出,25μg/mL尿酸样品的回收率为102.0%,50μg/mL尿酸用等体积的硼酸缓冲液稀释后的样品回收率为103.2%,表明专属性较好。尿酸质量浓度在0~50μg/mL范围内线性关系良好,R^(2)>0.99。该方法重复性验证的RSD为0.6%;中间精密度验证的RSD为1.4%;准确性验证的3个样品回收率分别为101.3%、101.3%、101%,RSD分别为1.1%、1.2%、0.7%;不同温度条件下,耐用性验证的RSD为4.8%。结论本实验建立了微孔板酶底物检测尿酸酶活性的方法,该方法的专属性、线性、重复性、中间精密度、准确性和耐用性良好,可用于尿酸酶活性的定量检测。

一种新型尿酸氧化酶四聚体提取纯化方法的建立

目的建立一种简便、快速的尿酸氧化酶四聚体提取纯化方法,以适应大规模生产需求。方法首先通过基因工程的方法获得可以稳定发酵生产尿酸氧化酶的大肠埃希菌菌株,再通过一步萃取法从破碎菌体沉淀中获得尿酸氧化酶蛋白混合物。通过硫酸铵沉淀、离子交换和分子筛层析,最终获得纯化的活性尿酸氧化酶四聚体。结果通过优化发酵及提取条件,每升发酵液可得到尿酸氧化酶四聚体蛋白约400 mg,其纯度>95%,比活>10 U/mg。结论建立了一种新的尿酸氧化酶四聚体高效提取纯化方法。