1株H1N1亚型猪流感病毒的进化分析及分子特征研究

【目的】鉴定贵州省猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)的流行株及其分子生物学特征,为猪流感的病原学研究和流行病学调查提供重要参考。【方法】从贵州省部分养殖场采集猪鼻腔拭子70份,采用RT-PCR和接种犬肾上皮细胞(MDCK)对疑似猪流感的阳性样品进行病毒分离鉴定,对分离株进行克隆测序获得全基因组序列,运用生物信息学在线软件分析毒株的遗传重组情况和关键氨基酸分子特征。【结果】试验分离到1株H1N1亚型SIV,命名为A/swine/Guizhou/ZY/2022(H1N1)。经全基因组测序和遗传进化分析结果显示,该毒株属于G4型欧亚类禽H1N1 SIV。生物信息学在线预测发现,分离株的HA和NA基因属于欧亚类禽H1N1分支,NS基因属于北美重组分支,其余基因片段属于2009年大流行H1N1分支。分离株的HA蛋白裂解位点为PSIQSR↓GL,存在4个潜在糖基化位点,其受体结合位点和抗原位点与欧亚类禽H1N1 SIV高度一致;NA蛋白结构完整,存在5个潜在糖基化位点;分离株PB2蛋白发生了Q ^(591) R、R ^(251 )K突变,PB1蛋白和M2蛋白分别发生了N^( 375) S、L^( 473 )V和S^( 31) N突变。【结论】从贵州省分离到1株三源重排H1N1亚型SIV,属于G4型欧亚类禽H1N1病毒,其与人源唾液酸α2,6-Gal受体的结合能力可能有所增强,提示需加强对猪流感的流行监测。

侧柏叶抗红色毛癣菌主要活性成分α-蒎烯以ERG-3为靶点发挥抗真菌作用

红色毛癣菌(Trichophyton rubrum,T.rubrum)是皮肤癣最主要病原;侧柏叶(Cacumen Platycladi)是侧柏[Platycladus orientali s(L.)Franco]的干燥嫩枝梢及叶,被《苗族医学》收录用于治疗皮肤癣。本研究旨在探讨侧柏叶抗T.rubrum的主要活性物质及其抗真菌机制,为抗皮肤癣新药研发提供帮助。本研究通过测定最小抑菌浓度和孢子萌发率分析了侧柏叶活性物质对T.rubrum的抑菌活性,使用电镜观察T.rubrum菌丝形态和孢子超微结构,并检测侧柏叶活性物质对T.rubrum细胞膜通透性、完整性和麦角甾醇含量的影响,从而阐述侧柏叶活性物质对T.rubrum抑菌机理,最后采用GC-MS和qRT-PCR方法找到其抗T.rubrum的作用靶点。结果显示,侧柏叶石油醚部位的α-蒎烯为主要抗菌活性成分,MIC为32μg·mL^(-1),极显著抑制孢子萌发(P<0.01);α-蒎烯可致细胞膜发生明显损伤和内容物流出、通透性极显著增加(P<0.01)以及24 h内细胞膜中麦角甾醇和24(28)脱氢麦角甾醇含量显著下降(P<0.05);引起脂质色谱图中ERG3活性抑制相关的“麦角甾烷-7,24-二烯-3β-醇”色谱峰出现;可极显著降低ERG3的相对表达量(P<0.01)。结果表明,α-蒎烯是侧柏叶中发挥抗T.rubrum活性最主要成分且以ERG3为其抗真菌靶点。

贵州省部分PEDV流行株ORF3基因克隆与遗传进化分析

为探究贵州省猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株的遗传进化情况,对2017—2022年贵州省不同地区13份PEDV阳性腹泻样本进行ORF3全基因扩增、克隆、测序,使用DNAstar、MEGA 7.0软件,对所得序列核苷酸和氨基酸同源性以及突变和遗传进化情况进行分析。结果显示:13份PEDV阳性样品的ORF3基因序列全长均为675 bp,编码224个氨基酸;13条克隆序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.1%~100%和96.4%~100%;13条克隆序列与经典毒株CV777株ORF3基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.9%~97.3%和94.7%~96.4%,同源性较低;与经典毒株CV777株相比,13条克隆序列在G160A、C243T、C274T、G301A、C450T、A497G存在相同的核苷酸突变,存在4个相同的氨基酸位点突变(V21A、V54I、A101T、N166S);13条克隆序列所在毒株在遗传进化上全部属于GⅡ型,其中GZ220514、GZ342、GZ224、GZ219、GZ423隶属于GⅡb亚型,GZ210112、GZ210129、GZ210220、GZ210714、GZ407、GZ210525、GZ330、GZ370属于GⅡa亚型(表明13份PEDV阳性样品所含毒株均为变异毒株);同一基因型的PEDV毒株ORF3基因相对较保守,但不同基因型差异较大;对所有参比株ORF3基因推导的氨基酸序列与CV777株进行比对,分析认为可以将25S、70V/F、80F、107F/V/L氨基酸突变模式作为GⅡa亚型的分子标记。本试验为分析贵州省PEDV流行以及遗传变异情况提供了参考,并丰富了贵州省PEDV ORF3基因序列。

从人民币汇率波动与中国进口美国汽车关系看中美贸易战

本文选取2012年1月—2017年12月的月度数据考查中国对美国汽车进口与人民币汇率之间的关系。研究发现,在2012年1月—2015年6月人民币汇率与汽车进口异向变化,2015年7月—2016年12月人民币币值与汽车进口同向变化。这表明人民币汇率与中国对美国汽车进口波动呈现时间特征,汇率波动对汽车进口的影响不大。

牛至油-青蒿素复方纳米乳制备及治疗鸡球虫病效果评价

制备牛至油-青蒿素复方纳米乳(OANE)并验证其治疗鸡球虫病的效果。自乳化法制备OANE,表征并考察其动力学、热力学稳定性;选取海兰褐蛋公雏400只,分为健康对照组、辅料对照组、感染组、OANE低剂量组、OANE中剂量组、OANE高剂量组、球虫散对照组和磺胺喹噁啉钠对照组8组。16日龄时,除A组外,其他各组均经口接种孢子化柔嫩艾美耳球虫卵囊(8×10^(4)个/只);感染后第5天,各组给予相应处理至第9天试验结束。以抗球虫指数(ACI)等综合评价治疗效果。结果显示,成功制备OANE,粒径分布、Zeta电位、稳定性等良好。试验期间,OANE中剂量组、高剂量组血便记分显著低于球虫散对照组(P<0.05),与磺胺喹噁啉钠对照组差异不显著(P>0.05);饲料转化率极显著高于感染组(P<0.01),与阴性对照组差异不显著(P>0.05);卵囊排出率显著低于感染组和鸡球虫散组(P<0.05或P<0.01),与磺胺喹噁啉钠组差异不显著(P>0.05),ACI达170以上;感染后第6天,血清丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)水平极显著低于(P<0.01)其余药物组,而总抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)相当或显著高于阳性药物对照组(P>0.05或P<0.05)。说明OANE中剂量、高剂量治疗鸡球虫病效果良好。

猪圆环病毒2型ORF9蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

为了鉴定并深入研究ORF9蛋白在猪圆环病毒2型感染中的作用,本研究制备了小鼠抗ORF9蛋白多克隆抗体并进行了初步应用。首先通过扩增克隆ORF9基因,构建原核表达质粒pET-32a(+)-PCV2-ORF9并转化至BL21(DE3)感受态细胞中,再利用SDS-PAGE对可能影响ORF9蛋白表达效果的因素(温度、IPTG浓度、时间)进行优化研究,随后将重组蛋白经纯化复性后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,用ELISA测定小鼠多抗效价,并用IFA和Western-blot方法对抗ORF9多克隆抗体特异性进行研究。结果显示,重组质粒p ET-32a(+)-PCV2-ORF9构建成功;ORF9重组蛋白在IPTG浓度为0.1 mmol/L、37℃条件下诱导4 h表达量最高,且主要以包涵体形式表达,分子量大小约24.2 ku;经ELISA检测制备的多抗效价为1∶6 400;IFA和Western-blot试验结果均证明ORF9蛋白能被PCV2阳性血清和小鼠多克隆抗体特异性识别。本研究成功表达并纯化了具备抗原性的PCV2 ORF9重组蛋白,制备的特异性抗PCV2 ORF9多克隆抗体为探究ORF9蛋白在PCV2感染中的作用奠定了基础材料。

猪轮状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

根据猪轮状病毒VP6基因序列保守区设计特异性探针和引物,建立一种特异、灵敏、通用、高效检测Po RV的实时荧光定量RT-PCR检测方法。扩增目的片段为173 bp,以构建的重组质粒p MD19-T-VP6为模板进行反应程序的优化。结果显示,该方法的标准曲线为y=-3.1139x+39.298,R^(2)=0.9937,E=109.5%;用该方法检测猪常发传染病病原时结果均为阴性;对标准品质粒的最低检测限为1.32 copies/μL;批内、批间变异系数分别小于0.600%、1.300%,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好。利用该方法检测114份临床腹泻病料,阳性检出率(39/114)优于常规RT-PCR(22/114),39份阳性样品经测序鉴定均为Po RV,扩增VP7基因后成功构建22份阳性质粒,测序结果显示共检出6种G型Po RV,检出率依次为9.09%(G3)、22.72%(G4)、18.18%(G5)、31.82%(G9)、4.54%(G11)、9.09%(G26)。上述结果表明,本试验建立了一种快捷、准确检出Po RV的Taq Man探针通用型实时荧光定量RT-PCR方法,对该病的诊断、病原监测、流行病学调查具有重要意义。

猪流感病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

参照GenBank登录的猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)基质蛋白(matrix protein,M)基因保守序列设计1对特异性引物和1个TaqMan探针,构建重组质粒作为绝对定量模板,通过优化反应体系及条件建立了检测SIV的荧光定量RT-PCR方法,测试了该方法的特异性、灵敏度及重复性。结果显示,建立的方法与猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪乙型脑炎病毒等不存在交叉反应,特异性强;最低检测限度为1.0拷贝/μL,比普通RT-PCR方法灵敏10倍;组内和组间重复性试验的变异系数分别在2.2%和1.9%以下,重复性较好;应用该方法对220份临床疑似猪流感样品进行检测,荧光定量RTPCR方法和普通RT-PCR检测率分别为2.7%和1.8%,阳性符合率为100%。结果表明,建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可快速检测样品中的各种SIV,从而更好地诊断和监测猪流感。

海兰灰蛋鸡ALV、FAdV-4和FAdV-8a的混合感染分析

为了查明贵州省某鸡场40~50日龄海兰灰蛋鸡突然发病死亡的原因,试验采集病死鸡组织/器官进行细菌分离培养和PCR检测,并将阳性PCR产物克隆至p MD-19T载体中,通过PCR和双酶切鉴定克隆菌液,对鉴定正确的克隆质粒进行测序,并与GenBank中的参考毒株进行序列比对,分析其核苷酸序列同源性和遗传进化情况。结果表明:病死鸡肝脏质脆、边缘坏死,心包充满黄色积液,从组织中未分离出细菌。有2只送检鸡病料同时扩增出大小为433 bp、385 bp、800 bp的目的基因片段,检出禽白血病病毒(Avian leucosis virus,ALV)、禽腺病毒血清4型(Fowl aviadenovirus 4,FAd V-4)、禽腺病毒血清8a型(Fowl aviadenovirus 8a,FAdV-8a),成功克隆出ALV p27基因、FAd V-4和FAdV-8a Hexon基因。分离株ALV GZ-ALV-1/2株与ALV内源性E亚型亲缘关系最近,与ALV E-NSAC-1株(登录号为FJ793550)的核苷酸序列同源性最高,为91.8%~91.9%;分离株FAdV-4 GZ-4-1/2与GenBank中FAd V-4参考毒株的亲缘关系最近,与FAd V-4国内株LC1611株(登录号为M N316650)的同源性最高,为93.3%~94.6%;分离株FAdV-8a GZ-8a-1/2株与GenBank中FAdV-8a参考毒株亲缘关系最近,与澳大利亚TR59株(登录号为EU979374)和国内SDRZ株(登录号为MF198256)的核苷酸序列同源性最高,为98.6%~98.9%。说明送检蛋鸡病因为FAdV-4、FAdV-8a和内源性E亚型ALV的混合感染。