甘蔗PIN-LIKES基因家族的鉴定与表达分析

PILS(PIN-LIKES)是一类新发现的生长素输出载体,协助生长素的极性运输。本研究立足甘蔗割手密基因组和栽培品种转录组数据,利用生物信息学分析技术,分别在割手密和栽培品种中鉴定到11个PILS(Saccharum spontaneum PIN-LIKES,SsPILS)基因和4个PILS(Saccharum spp.hybrid PIN-LIKES,ScPILS)基因。结果表明,11个SsPILS基因家族成员分布于6条染色体上,基因内含子数量介于5~11个。系统进化树分析发现,割手密PILS与水稻PILS有较高同源性,归属于3个不同的系统发育分支。转录组数据分析显示,SsPILS1c的同源基因ScPILS1c在受高粱花叶病毒和黑穗病菌胁迫甘蔗栽培种中差异表达。通过RT-PCR扩增技术,克隆获得ScPILS1c基因序列(NCBI accession number:OM258732)。该基因全长cDNA为1332 bp,包含一个1233 bp的完整开放阅读框,编码410个氨基酸,理论等电点(pI)为6.17,不稳定系数为39.31,平均疏水性值为0.689,预测ScPILS1c为稳定酸性疏水蛋白。其编码蛋白的二级结构主要包括α-螺旋(48.54%)和无规则卷曲(35.37%),这与三级结构预测结果相符。qRT-PCR表达分析揭示,ScPILS1c基因在甘蔗中的表达具有组织特异性,在蔗髓中表达量最低、皮中的表达量最高,同时该基因的表达受H2O2及黑穗病菌的显著性诱导。亚细胞定位表明,ScPILS1c基因的编码蛋白主要定位于细胞膜。以上结果为深入研究甘蔗PIN-LIKES基因的结构和功能积累了基础资料。

番茄SlN-like的克隆、表达与抗病毒功能

【目的】番茄(Solanum lycopersicum)作为重要的蔬菜作物,其生长受到包括害虫、真菌、细菌和病毒等各种生物因素的危害。明确番茄抗性基因SlN-like的抗病毒功能与机制,为番茄的抗病毒育种与抗病毒药剂的靶向开发提供理论依据。【方法】从茄科植物基因组数据库Solanaceae Genomics Network中获得SlN-like的全长,并将其分为4段,利用融合聚合酶链式反应(fusion PCR)扩增获得SlN-like的序列全长;通过生物信息学分析SlN-like的进化关系、蛋白特征、保守结构域、亚细胞定位以及互作关系;通过实时荧光定量PCR分析SlN-like在番茄根、茎、叶、花和果实中的表达情况及其在烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)侵染后的叶片表达量;借助烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默技术(virus induced gene silencing,VIGS)沉默番茄内源SlN-like,摩擦接种TMV-GFP于沉默植株,明确SlN-like对病毒侵染的影响。实时荧光定量PCR分析沉默植株中脱落酸(abscisic acid)、茉莉酸(jasmonic acid)和乙烯(ethylene)激素相关基因的表达量及SlN-like在外施乙烯利(ethephon,ETH)3、6、12、24 h后的表达情况,最终明确SlN-like调控激素途径响应病毒侵染的机制。【结果】通过分子克隆与融合PCR技术,从番茄品种Micro-Tom中克隆获得全长3444 bp的SlN-like,上传至NCBI获得序列号MW792493。通过生物信息学分析发现SlN-like含有TIR、NB-ARC和NACHT结构域,并与马铃薯(Solanum tuberosum)N-like(AAP44394.1)亲缘关系最近。SlN-like在番茄各组织中均有表达,在茎中的表达量最高,其次是根、花,叶和果实中的表达量最低。TMV-GFP侵染番茄后第5、7天SlN-like的表达显著高于PBS处理,分别是PBS处理的1.6和2.2倍,并且TMV-GFP侵染会使SlN-like的表达持续升高。TRV载体介导沉默番茄的SlN-like,发现沉默78.3%的SlN-like不会影响番茄生长表型,但可促进TMV-GFP侵染;实时荧光定量PCR分析发现沉默植株中ERF1的表达显著降低,仅为对照组的12.5%;外施乙烯利处理番茄3 h后SlN-like表达量升高,并在12 h达到最高峰,是对照组的2.71倍,24 h后恢复正常。【结论】番茄SlN-like属NBS-LRR类抗病蛋白,其表达受TMV侵染诱导,沉默SlN-like促进TMV-GFP侵染,降低乙烯相关基因ERF1的表达,而外施乙烯利导致SlN-like的差异表达,揭示了SlN-like作为正调控因子可能影响乙烯途径介导的番茄抗病毒防御。

本氏烟NbMBF1c的克隆、表达及在TMV侵染过程中的功能

【目的】烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)是危害茄科、十字花科、葫芦科等农作物的重要病毒,给农业生产造成了巨大损失。通过分子克隆获得本氏烟(Nicotiana benthamiana)多蛋白桥梁因子1c(multiprotein bridging factor 1c,MBF1c),综合应用生物信息学、细胞生物学以及分子生物学手段,明确NbMBF1c的抗病毒功能和机制,为作物的抗病毒育种提供理论依据。【方法】根据Sol Genomics Network中报道的NbMBF1c序列全长,设计引物克隆NbMBF1c全长序列;使用GeneDoc及MEGA X对NbMBF1c蛋白和其他物种中的同源蛋白序列进行比对并构建系统进化树;利用生物信息学分析NbMBF1c的基因特征和蛋白结构;使用实时荧光定量PCR检测其组织表达及其在TMV侵染中的表达;利用烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技术沉默NbMBF1c后通过摩擦接种TMV-GFP,明确NbMBF1c对病毒侵染的影响;构建pART27-GFP-NbMBF1c和pART27-Myc-NbMBF1c瞬时过表达载体,在本氏烟叶片中表达融合蛋白GFP-NbMBF1c后在共聚焦显微镜下观察亚细胞定位,表达融合蛋白Myc-NbMBF1c后接种病毒观察TMV-GFP侵染情况;采用实时荧光定量PCR检测沉默NbMBF1c后相关激素基因的表达,分析NbMBF1c影响病毒侵染的机制。【结果】NbMBF1c全长441 bp,编码146个氨基酸,包含一个保守结构域HTH(helix-turn-helix);系统发育分析表明,NbMBF1c与绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)MBF1c(XP_009614458.1)亲缘关系最近;NbMBF1c的表达具有特异性,在根中的表达量最高,其次是茎、叶和花;NbMBF1c定位于细胞质和细胞核中;沉默NbMBF1c会显著影响本氏烟株高,出现矮化等症状,接种TMV-GFP第5天时,沉默处理相较于对照组植株新叶病毒含量更高;瞬时过表达Myc-NbMBF1c融合蛋白,在注射叶接种TMV-GFP后,病毒侵染减少,但NbMBF1c并不与TMV组分互作;沉默NbMBF1c后,脱落酸(abscisic acid,ABA)合成关键酶基因NCED3、脱落酸受体PYL1、ABA信号转导因子ABAI1和蛋白激酶SnRK2E的表达量显著上调;茉莉酸(jasmonic acid,JA)合成途径AOS1上调表达,茉莉酸信号通路上的受体COI1下调表达。【结论】本氏烟MBF1家族NbMBF1c的表达受TMV侵染诱导,且主要定位于细胞质和细胞核。NbMBF1c作为植物抗TMV的正调控因子抑制病毒在本氏烟上的侵染。NbMBF1c不通过与TMV组分互作来抑制病毒侵染,而是通过调控植物激素的产生和信号传导来抑制病毒侵染。

本氏烟半胱氨酸蛋白酶基因家族特征及其在TMV侵染中的功能

【目的】明确抗病毒化合物氯吲哚酰肼(chloroinconazide,CHI)诱导的本氏烟(Nicotiana benthamiana)半胱氨酸蛋白酶(cysteine proteinase,CP)在烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)侵染过程中的作用及其基因家族特征,为理解茄科作物抗病毒分子机制及化学调控提供理论依据。【方法】利用全基因组策略,从茄科作物基因组数据库Sol Genomics Network中检索获得本氏烟NbCP的全家族基因序列,利用生物信息学分析NbCP基因家族的进化关系、Motif基序及启动子顺式作用元件。根据生物信息分析结果,利用实时荧光定量PCR技术分析TMV侵染后NbCP基因的表达,以此筛选出潜在抗病蛋白。使用烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默技术和马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)介导的基因过表达技术验证该关键蛋白对TMV-GFP侵染的影响,结合实时荧光定量PCR手段探索该关键蛋白的抗病毒机制。【结果】NbCP家族共有24个成员,根据其染色体定位命名为NbCP1—NbCP24。进化关系分析表明NbCP分成5个亚家族,其中Group V含有7个NbCP,而Group I仅含2个NbCP;Motif分析表明不同分支NbCP具有相似的motif分布;启动子顺式作用元件分析表明NbCP家族基因受光调控,并且多个NbCP家族基因启动子含有茉莉酸甲酯、水杨酸甲酯、脱落酸、赤霉素和生长素等激素响应元件。结合生物信息学分析,从上述各个亚家族中分别筛选1个关键潜在抗病相关NbCP基因(NbCP8、NbCP12、NbCP13、NbCP18、NbCP22),并利用实时荧光定量PCR技术分析上述基因在TMV侵染第5天的表达,发现NbCP8表达差异性最大,上升了2.6倍,NbCP8在叶中的表达量最高,其次是茎和根,在花中的表达量最低。TRV介导的NbCP8沉默能显著增加TMV-GFP的侵染,而PVX介导的NbCP8过表达能显著抑制TMV-GFP侵染,表明NbCP8作为植物正调控因子抑制病毒侵染。沉默NbCP8显著抑制了水杨酸信号途径相关基因PR1以及茉莉酸信号途径相关基因MYC2的表达,但对NPR1、COI1以及脱落酸信号途径相关基因ABA1和NCED1的表达无显著影响;而过表达NbCP8则显著提高了PR1以及ABA1的表达,但对NPR1、MYC2、COI1和NCED1的表达无显著影响。【结论】本氏烟NbCP参与了植物胁迫防御,其中NbCP8在抗TMV防御中起显著作用,其分子机制是通过诱导水杨酸信号途径参与抗病防御,研究结果可为茄科作物抗病毒的分子机制提供证据。

重庆地区烟叶辣椒脉斑驳病毒的检测与鉴定

为确定重庆烟区烟草叶片上出现黄化斑点、枯斑等症状的病原,进而制定出科学的综合防治措施,对采自重庆市涪陵和巫溪烟区与北碚试验田的18份烟叶样品进行了病毒种类检测与鉴定。根据病毒外壳蛋白基因序列设计了特异性引物,采用RT-PCR扩增及BLAST序列对比分析,结果表明:涪陵烟区烟叶上出现黄化斑点、枯斑等症状的样品中检测出烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV),检出率分别为54.55%和100%;巫溪烟区样品中检测出TMV和马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY),检出率分别为100%和66.67%;北碚烟草试验田病叶样品中检测出ChiVMV,检出率为100%。其中,ChiVMV为重庆地区烟草上首次发现。