乳酸对人非小细胞肺癌细胞A549生物学特性影响的研究

背景肿瘤的重要特征之一是代谢异常,乳酸作为代谢产物也参与肿瘤代谢。目的探讨乳酸对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞A549糖酵解压力、增殖、迁移和周期等生物学特性的影响。方法培养人非小细胞肺癌细胞A549,分为对照组、5 mmol/L乳酸处理组和10 mmol/L乳酸处理组。对照组不作任何处理,其他两组乳酸处理24 h后,通过Seahorse细胞代谢分析仪分析乳酸处理后A549细胞的糖酵解压力和线粒体底物选择,qPCR检测糖酵解相关基因(HK3、LDHA、LDHB、PKM)和细胞周期及迁移相关基因(CCNE1、CCND1、CCNB1、CDK2、CDH1、TWIST1、SNAI2)mRNA表达水平,Western blot检测糖酵解相关蛋白(G6PD、PKM2、HK1和LDHA)水平。利用实时无标记细胞分析(real time cellular analysis,RTCA)、流式细胞术分析乳酸对NSCLC细胞A549增殖、迁移、周期等生物学特性的影响。结果两个乳酸处理组相较对照组糖酵解降低,糖酵解最大能力及糖酵解储备均降低且10 mmol/L乳酸处理组比5 mmol/L组降低更显著(P<0.05),糖酵解关键酶在mRNA和蛋白水平下调。10 mmol/L乳酸处理组与对照组相比,对脂肪酸的依赖性增强,对谷氨酰胺的氧化能力减弱(P<0.05);RTCA结果显示两个乳酸处理组相较对照组细胞迁移降低,增殖能力降低,10 mmol/L乳酸处理组较5 mmol/L组增殖和迁移能力下降更为显著(P<0.05)。两个乳酸处理组CCNE1、CCND1、CCNB1、TWIST1基因m RNA水平下调,CDK2、CDH1基因mRNA水平上调。流式结果显示10 mmol/L乳酸处理组G0/G1期细胞增多(P<0.01),S期细胞数量降低(P<0.05),G2/M期细胞数量降低(P<0.05)。结论加入外源乳酸处理后,A549细胞糖酵解能力降低,且与乳酸浓度呈负相关,细胞氧化底物变化,随着乳酸浓度的增加其细胞增殖及迁移能力显著降低,通过细胞周期结果分析后推测加入外源乳酸可能使A549细胞抑制在G1期。

环形泰勒虫裂殖体表面蛋白基因PCR诊断方法的建立

为寻求一种快速灵敏的环形泰勒虫病PCR检测方法,基于环形泰勒虫裂殖体表面蛋白(Theirelia annulata surface protein,TaSP)基因序列保守区设计特异性引物,通过PCR技术扩增出该基因长为393bp的高免疫原性区片段。用该引物对环形泰勒虫、中华泰勒虫、瑟式泰勒虫、尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、绵羊泰勒虫、马泰勒虫、驽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫基因组模板进行特异性试验,对环形泰勒虫基因组模板进行梯度稀释后扩增,以确定试验的敏感性,同时用本试验建立的方法与常规显微镜镜检方法对150份血清样品进行检测。特异性试验结果显示,在被检测的9个样本中,只有环形泰勒虫基因组模板中扩增出了符合大小的特异核苷酸片段;敏感性试验结果表明,PCR对环形泰勒虫的扩增效率可达到10-10;通过对150份血清样品的检测,并与血涂片方法进行比较,结果显示PCR方法具有特异性强、敏感度高等特点,适用于牛环形泰勒虫病的检测。

亚洲璃眼蜱不同发育阶段及其组织中microRNA-10表达分析

【目的】MicroRNA(miRNA)是一类长度为20—22个核苷酸(nt)且高度保守的非编码小RNA。迄今为止,在病毒、动物、植物中都有发现,如在Mareks病毒、果蝇、斑马鱼、人类以及拟南芥等多种生物中都有存在。其通过与靶基因特异性的碱基互补配对使靶基因降解或者受到抑制,在转录后水平调控靶基因的表达水平。miRNAs参与多种生物的细胞增殖、分化、代谢与死亡等多种生物学过程。为了解microRNA-10在亚洲璃眼蜱中的潜在生物学功能,试验获得亚洲璃眼蜱miR-10的前体、成熟体序列;分析亚洲璃眼蜱不同发育阶段及组织miR-10的表达水平,及亚洲璃眼蜱miR-10的生物学意义;为进一步研究miR-10与亚洲璃眼蜱生长发育间的关系奠定基础。【方法】用Trizol Reagent分别提取不同发育阶段及组织的总RNA,用SYBR?Prime Script TMmiRNA RT-PCR Kit(TaKaRa Code:RR716)制备cDNA。参考miRBase数据库中isc-miR-10(登录号:MI0012262)序列,设计特异性引物,通过PCR的方法从亚洲璃眼蜱中扩增获得miR-10前体序列,通过MEGA4软件将此前体序列与已知物种的miR-10前体序列进行比对分析;利用qPCR技术分析亚洲璃眼蜱不同发育阶段及组织miR-10的表达情况;推测miR-10在亚洲璃眼蜱中的生物学功能。【结果】获得亚洲璃眼蜱miR-10的前体序列CUACAUCUACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUUUGCCACUAGACUACAAAUUCGGUUCUAGAGAGGCUUUGUGUGG,大小为73bp;亚洲璃眼蜱的miR-10前体序列与肩突硬蜱的相似性最高,是95.9%,且与其他节肢动物相似性在88.9%—91.7%之间;miR-10在不同物种间高度保守。miR-10的成熟体序列为UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGU,种子序列为ACCCUGU。在亚洲璃眼蜱的不同发育阶段中,饥饿若蜱的miR-10的表达水平最高,是卵的48.3倍;饥饿成蜱是卵的7.78倍;饥饿幼蜱是卵的2.78倍。在饥饿雌性成蜱吸血过程中,吸血3d的成蜱是饥饿成蜱的约4.28倍,吸血5d的成蜱是饥饿成蜱的约0.31倍,饱血自然脱落的成蜱是饥饿成蜱的约0.087倍。吸血初期miR-10的表达量上调,随着吸血时间的延长其表达量逐渐下调;在唾液腺、气管、卵巢、表皮、中肠中miR-10的表达情况有明显不同,其中唾液腺的表达量最高,是表皮的13.2倍;卵巢的表达量是表皮的2.98倍,气管的表达量是表皮的6.46倍。【结论】从亚洲璃眼蜱中克隆miR-10序列,序列分析显示此序列在节肢动物中相对保守。miR-10在亚洲璃眼蜱不同发育阶段及不同组织的表达明显不同,表明其表达具有选择性;依据miR-10表达的差异性及已报道miR涉及的生物学功能,推测miR-10在亚洲璃眼蜱的细胞增殖、发育及吸血方面有潜在的重要作用。本研究为寄生虫miRNAs功能的研究提供一定的依据,并有可能为防控寄生虫疾病开辟新的途径。

18S rRNA序列差异在马梨形虫分类学中的应用

为揭示18SrRNA V4高变区在物种分类学的本质意义,及进一步阐述马泰勒虫(之前称马巴贝斯虫)的分类学地位,本试验参考马泰勒虫(DQ287951)和驽巴贝斯虫(FJ209026)18SrRNA基因序列,在其V4高变区设计引物。将获得的片段克隆至pMD19-T进行测序,正确的结果与其他种梨形虫的相应序列进行分析。系统发生树结果显示,泰勒虫和巴贝斯虫处于明显的两个分支,而称之为马巴贝斯虫的物种和泰勒虫有着较为密切的关系,他们处于同一分支,其亲缘关系较巴贝斯虫更远。序列对齐分析表明,巴贝斯虫核苷酸序列相对于泰勒虫种序列存在多个位点的缺失和突变。而马巴贝斯虫和泰勒虫18SrRNA V4高变区核苷酸序列的相似程度较高,与巴贝斯虫在该序列上的差异较大。以上结果表明,泰勒虫种和巴贝斯虫种18SrRNA V4高变区核苷酸序列间的这种缺失和突变可作为泰勒虫和巴贝斯虫分类依据的本质因素之一。马巴贝斯虫应隶属于泰勒虫科,泰勒虫属。

乳酸上调非小细胞肺癌细胞中总胆固醇水平的机制研究

背景胆固醇与非小细胞肺癌发生相关并增强非小细胞肺癌细胞耐药性,研究显示乳酸能通过降低pH使SREBP2活化进而上调细胞内胆固醇水平。目的探索乳酸调节非小细胞肺癌细胞内总胆固醇水平的其他分子机制。方法分析TCGA数据库中非小细胞肺癌乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)与胆固醇合成代谢酶基因表达水平的相关性。将人肺支气管上皮细胞BEAS-2B和人非小细胞肺癌细胞H1299分为对照组(正常培养)和乳酸处理组(在培养基中添加乳酸),将人非小细胞肺癌细胞A549分为对照组(正常培养)、乳酸处理组(在培养基中添加乳酸)和盐酸处理组(在培养基中添加盐酸)。利用总胆固醇测定试剂盒测定细胞内总胆固醇水平,qPCR测定细胞内胆固醇合成代谢酶基因的mRNA水平。利用染色质免疫共沉淀分析对照组和乳酸处理组A549细胞中胆固醇合成代谢酶基因启动子区组蛋白乳酸化水平。结果Wilcoxon秩和检验分析TCGA数据结果显示,LDHA高表达的非小细胞肺癌细胞中胆固醇合成代谢酶基因HMGCR、ACAT1、ACAT2、SQLE和FDFT1表达水平升高(P<0.05)。独立样本t检验分析对照组和乳酸处理组细胞内总胆固醇水平及胆固醇合成代谢酶基因的mRNA水平,结果显示,与对照组细胞相比,乳酸处理组BEAS-2B、A549和H1299细胞内总胆固醇水平升高(P<0.01),且乳酸处理组BEAS-2B和A549细胞中HMGCR、FDPS、GGPS1和SQLE基因mRNA水平也升高(P<0.01)。与对照组相比,乳酸和盐酸处理组A549细胞内总胆固醇水平均升高(P<0.05),且HMGCR和FDFT1基因mRNA水平也升高(P<0.01),但盐酸的作用显著弱于乳酸(P<0.01)。染色质免疫共沉淀结果显示,乳酸处理组A549细胞中HMGCR、SQLE和GGPS1基因启动子区组蛋白乳酸化水平有升高趋势;与对照组相比,乳酸处理组A549细胞内总胆固醇水平升高(P<0.01),而乳酸脱氢酶抑制剂草氨酸钠能逆转乳酸上调A549细胞内总胆固醇水平(P<0.01)。结论乳酸能上调非小细胞肺癌细胞内总胆固醇水平,该过程可能的分子机制为组蛋白乳酸化修饰促进胆固醇合成代谢酶基因表达,且乳酸通过转化为乙酰辅酶A参与胆固醇合成。

细粒棘球蚴脂肪酸转运蛋白生物学特性分析

本研究根据NCBI GenBank数据库中的Eg-FATP氨基酸序列,采用生物信息学方法分析细粒棘球蚴脂肪酸转运蛋白(Eg-FATP)理化性质,亚细胞定位、抗原表位、信号肽、跨膜区二级和三级结构、系统进化树、蛋白互作网络等,并通过qPCR方法探究其在原头蚴和包囊壁的差异表达,旨在为后期相关的研究提供理论支持和数据参考。结果显示,Eg-FATP蛋白无信号肽,无跨膜区,亚细胞定位于细胞质;该蛋白有10个B细胞线性表位和14个CTL细胞表位;系统发育分析显示:细粒棘球蚴的FATP蛋白与多房棘球蚴亲缘关系较近,细粒棘球蚴中国株和英国株之间的氨基酸序列同一性较高,为97%左右。预测的互作功能蛋白可能参与胆固醇代谢的调节、脂肪酸跨血屏障的转运等过程;GO和KEGG富集分析结果显示,Eg-FATP对长链和超长链脂肪酸具有酰基辅酶A连接酶活性;qPCR结果显示,FATP基因在原头蚴阶段转录水平较高于包囊壁,具有统计学意义(P<0.05)。本研究对细粒棘球蚴FATP基因的生物学特性进行了初步分析,为进一步揭示其生物学功能奠定了基础。

蛋白磷酸酶4在缺血性脑卒中大鼠肝、脑组织中的差异表达

目的探讨蛋白磷酸酶(PP)4在缺血性脑卒中大鼠肝、脑组织中的表达是否存在差异。方法45只健康雄性SD大鼠随机分为正常(NORMAL)组、假手术(SHAM)组、大脑中动脉阻塞(MCAO)组各15只,MCAO组再分为MCAO-2 h组、MCAO-6 h组、MCAO-12 h组3个亚组(各5只)。通过改良线栓法建立MCAO模型模拟缺血性脑卒中。采用尼氏染色观察脑组织形态学改变;经qPCR及Western印迹测定脑卒中后PP4 mRNA及蛋白水平的变化。结果尼氏染色显示MCAO组梗死区尼氏小体数量减少,随时间延长,尼氏小体数量递减,NORMAL组和SHAM组未见明显异常;MCAO-2 h组、MCAO-6 h组、MCAO-12 h组脑组织PP4C mRNA水平较NORMAL组显著降低(P<0.05,P<0.001);MCAO-2 h组肝组织PP4C mRNA水平较NORMAL组显著升高(P<0.001);MCAO-2 h、MCAO-6 h组脑肝组织PP4R2蛋白水平较NORMAL组显著降低(P<0.001,P<0.01);MCAO-2 h组、MCAO-6 h组、MCAO-12 h组肝组织PP4R2蛋白水平较NORMAL组显著升高(P<0.01);除MCAO-12 h组肝组织PPX蛋白水平较NORMAL组显著降低(P<0.01)外,各组脑组织、肝组织PPX蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论PP4在缺血性脑卒中肝、脑组织表达存在差异,提示可能参与了缺血性脑卒中缺氧的适应。

缺氧对不同组织线粒体功能影响的研究进展

线粒体是有氧呼吸的主要场所,在缺氧条件下,线粒体的形态及能量代谢会发生一系列的变化去适应有限的氧环境。该研究从目前国内外的研究现状出发,分析了缺氧环境下,心肌细胞、脑细胞、肺动脉平滑肌细胞及骨骼肌细胞的线粒体能量产生异常、线粒体膜电位及膜通透性改变、钙离子超载、活性氧产生过多,引起氧化应激、自噬及凋亡等反应,造成线粒体功能障碍,从而引起机体组织损伤;指出了线粒体在适应缺氧过程中的重要性;最后总结了目前关于缺氧对线粒体影响的研究局限性及未来研究方向。

神经元线粒体转录因子A对缺血性大鼠脑卒中的作用

目的明确神经元线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)对缺血性大鼠脑卒中的作用.方法通过线栓法建立大鼠右侧缺血性脑卒中模型;采用qPCR及Westernblot法测定脑卒中后TFAM基因及蛋白的变化;通过流式细胞术检测线粒体膜电位及神经元凋亡水平.结果①qPCR分析显示,缺血2h MCAO组TFAM的mRNA表达较两对照组高(P<0.05),缺血6h时最低(P<0.05),12 h时表达稍增加,但与6h结果无显著性差异.②Western blot分析显示,缺血2h MCAO组TFAM表达较两对照组高(P<0.05),缺血6h时最低(P<0.05),缺血12 h时,TFAM的表达高于两对照组.③流式细胞术分析显示,缺血2h MCAO组线粒体膜电位下降和凋亡水平较两对照组明显(P<0.05),缺血6h时线粒体膜电位逐渐恢复,凋亡水平降低,12 h线粒体膜电位较6h降低,凋亡水平升高.结论脑缺血2h时TFAM的表达水平可能因应激作用增加,但并不能抑制神经元线粒体膜电位的降低和神经元的早期凋亡;脑缺血6h后,TFAM的转录可能因神经元坏死而受到影响,TFAM表达逐渐稳定,在神经元损伤时对维持神经元线粒体膜电位状态及神经元凋亡水平可能起了一定作用.

油酸对非酒精性脂肪肝细胞活性氧、周期及凋亡的影响

目的研究油酸对非酒精性脂肪肝细胞活性氧、周期及凋亡的影响。方法处理组用60μg/ml油酸处理小鼠正常肝细胞AML-1224、48、72h,对照组不作任何处理。检测细胞培养后上清甘油三酯、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶生化指标,油红O染色观察非酒精性脂肪肝细胞脂滴形成。EdU染色观察肝细胞增殖,利用流式细胞术检测肝细胞ROS、周期及凋亡。结果在24、48及72h时,处理组甘油三酯含量比对照组高(P<0.05)。天冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶24、48h结果变化比较,差异无统计学意义(P>0.05),在72h时升高(P<0.05)。油红O染色显示脂滴形成明显(P<0.05)。油酸处理72h后EdU染色显示进入S期细胞增多(P<0.05)。流式结果显示ROS比对照组升高(P=0.000),G 0/G 1期细胞降低(P<0.01),S期细胞数量增多(P<0.05),G 2/M期没有变化(P>0.05),同时肝细胞凋亡比对照组高(P=0.000),坏死比对照组高(P<0.01)。结论非酒精性脂肪肝细胞油酸的代谢产生大量ROS,可能使细胞阻滞在S期,促使了肝细胞的凋亡和坏死。

大鼠感染泡球蚴后外周血及脾脏中滤泡辅助T淋巴细胞的变化

目的分析泡球蚴感染宿主后外周血和脾脏中滤泡辅助T淋巴细胞(Tfh)水平与包虫病进展的关系。方法20只SD大鼠随机分为正常对照组和模型组,每组10只,模型组开腹直视下在右肝接种约2000个原头节,对照组不做任何处理,3个月后麻醉处死SD大鼠,取外周血和脾脏细胞,以CD4^(+)CXCR5^(+)PD1^(+)为Tfh细胞的标记,使用流式细胞术检测外周血和脾脏中Tfh细胞的水平。使用t检验比较两组之间Tfh细胞的差异。结果大鼠感染泡球蚴3个月后,肝脏可见明显病灶,HE染色显示病灶中可见原头节。泡球蚴感染模型组外周血中CD4^(+)CXCR5^(+)PD1^(+)Tfh细胞在CD4+细胞中的平均占比为25.63%±3.47%,正常对照组为11.12%±2.94%,2组比较差异有统计学意义(t=10.230,P<0.001),模型组CD4^(+)CXCR5^(+)PD1^(+)Tfh细胞在所有细胞中所占的比例较正常对照组下降显著(0.08%±0.02%vs 0.18%±0.05%,t=5.520,P<0.001);在所有细胞中,模型组脾脏中CD4^(+)CXCR5^(+)PD1^(+)Tfh细胞所占的比例(3.00%±0.42%)显著低于正常对照组(5.30%±1.40%)(t=4.769,P<0.001)。结论外周血中Tfh细胞与包虫病进展密切相关,有望成为反应泡球蚴感染的指标。

长角血蜱MLC基因的原核表达及表达产物的免疫原性分析

为了解长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)肌球蛋白碱轻链(MLC)基因表达产物的免疫学活性,利用RT-PCR方法扩增了长角血蜱MLC基因的完整开放阅读框,将该基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1中进行表达,在37℃、1.0mmol/L IPTG诱导条件下,用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况。结果表明,该重组蛋白的表达分子质量为44ku。Western-blotting结果显示,MLC蛋白能被兔抗长角血蜱成蜱阳性血清识别,表明MLC蛋白具有良好的反应原性。

马泰勒虫EMA1基因的克隆与生物学特性分析

根据GenBank上登录的马泰勒虫美国株(AB043618)裂殖子表面蛋白抗原1(EMA1)基因,设计了2对引物,采用PCR技术首次扩增出我国马泰勒虫肇源株EMA1基因。将该基因克隆到pMD19-T载体后,进行序列测定及分析。将鉴定为阳性的克隆重组到原核表达载体pET-30a后进行表达,并纯化表达的重组蛋白,进行Western-blotting试验,以鉴定其生物学活性。结果,EMA1基因长819bp,编码272个氨基酸,将该基因编码蛋白的氨基酸序列与GenBank中登录的11种已知梨形虫的相应氨基酸序列进行比较分析,马泰勒虫肇源分离株与已报道的马泰勒虫(马巴贝斯虫)亲缘关系最近,其次是环形泰勒虫和斑羚泰勒虫,而与东方泰勒虫、瑟氏泰勒虫的亲缘关系较远。表达的重组蛋白是分子质量约为38ku的融合蛋白,且表达产物能被马泰勒虫标准阳性血清识别。结果表明,马泰勒虫EMA1作为一种良好的抗原分子,在虫株的分类学研究、流行病学调查以及候选疫苗的研制中有着重要的意义。

长角血蜱4D8基因的克隆与原核表达

根据GenBank上登录的蜱4D8基因序列设计引物,用PCR技术从长角血蜱雌蜱研磨组织cDNA中扩增出4D8基因,将其连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T-4D8,并对检测为阳性的克隆进行测序。将该基因重组至原核表达载体pGEX-4T-1,经表达纯化后,进行Western-blot试验鉴定其生物学活性。结果,长角血蜱4D8基因的氨基酸序列与青海血蜱、肩突硬蜱的同源性分别为90%、81%。表达的重组蛋白是分子质量约为41ku的融合蛋白。Western-blot试验证明,该重组蛋白能很好地识别兔抗长角血蜱全蜱阳性血清。结果表明,4D8基因作为一种重要的分子标记基因在蜱的流行病学调查方面有着重要的价值,同时作为潜在的候选抗原基因在疫苗的研究方面也有重要意义。

几种蜱MLP基因的表达及其表达产物反应原性的分析

通过对饥饿的长角血蜱雌性成蜱cDNA表达文库中筛选到的未知基因进行5′RACE扩增,以期获得长角血蜱MLP基因全长cDNA序列。设计通用引物,采用PCR方法分别从青海血蜱、麻点璃眼蜱、森林革蜱、微小牛蜱及小亚璃眼蜱中对MLP基因完整的开放阅读框进行了扩增,并将其克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒,转入BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,分别用SDS-PAGE和Western-blot分析目的蛋白的表达情况和反应原性。结果表明,成功扩增了长角血蜱的MLP基因全长序列及多个蜱种的MLP基因开放阅读框序列,体外高效诱导表达了约39.2ku的不同蜱的MLP重组蛋白。Western-blot结果表明,长角血蜱的MLP重组蛋白具有很强的反应原性,且不同蜱的重组蛋白间具有很强的交叉反应性。

四种蜱源MIF基因的原核表达及表达产物的反应原性分析

为研究不同蜱源巨噬细胞移动抑制因子(MIF)基因的生物学特性,本研究设计了1对特异性引物,采用PCR从亚洲璃眼蜱、青海血蜱、血红扇头蜱、麻点璃眼蜱中扩增MIF基因的完整阅读框,并对该序列一级结构特征进行分析。PCR产物经BamHⅠ+EcoRⅠ双酶切后亚克隆到表达载体pGEX-4T-1上,重组质粒转入感受态细胞BL21(DE3),37℃下用1mmol/L IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析MIF基因体外的表达特征;接着用亚洲璃眼蜱全蜱血清与四种不同蜱种MIF重组蛋白进行Western-blot分析。结果显示,MIF基因完整阅读框全长351bp,编码116个氨基酸。氨基酸比对结果显示,亚洲璃眼蜱、青海血蜱、血红扇头蜱、麻点璃眼蜱MIF基因推导的氨基酸序列与已知的长角血蜱MIF基因推导的氨基酸序列相似性分别为98%、93%、93%、92%。SDS-PAGE结果显示,诱导的MIF重组蛋白的分子质量约为38.5ku。亚洲璃眼蜱全蜱血清与亚洲璃眼蜱MIF重组蛋白有较强的反应原性,且该血清与青海血蜱、血红扇头蜱、麻点璃眼蜱MIF重组蛋白存在交叉反应。结果表明,蜱MIF是一种良好的抗原分子。

多房棘球蚴对巨噬细胞糖代谢表型转变及极化类型影响的初步研究

目的探讨多房棘球蚴对巨噬细胞糖代谢表型转变、极化类型及炎症反应的影响,为多房棘球蚴病发病机制研究提供参考。方法分离6~8周龄C57BL/6J小鼠骨髓细胞,用小鼠巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony⁃stimulat⁃ing factor,M⁃CSF)诱导成骨髓巨噬细胞(bone marrow⁃derived macrophage,BMDM)⁃M0(对照组);以BMDM⁃M0经白细胞介素(interleukin)⁃4诱导24 h后的M2型巨噬细胞作为IL⁃4诱导组,以BMDM⁃M0与2.4 ng/mL多房棘球蚴囊液(cystic fluid,CF,)共培养的细胞作为BMDM与多房棘球蚴CF共培养组,以BMDM⁃M0与多房棘球蚴原头节(protoscolex,PSC)按500∶1共培养的细胞作为BMDM与PSC共培养组。采用流式细胞术分析与多房棘球蚴CF、PSC共培养后的巨噬细胞极化类型,用实时荧光定量PCR(fluorescent quantitative real⁃time PCR,qPCR)、Western blotting分析其标志物、炎症因子、糖代谢相关酶的表达水平,并通过细胞能量代谢分析各组细胞葡萄糖代谢表型。结果4组细胞精氨酸合酶1(arginase⁃1,Arg1)(F=1457.00,P<0.0001)、巨噬细胞衍生趋化因子22(macrophages⁃derived C⁃C motif chemokine 22,Ccl22)(F=22203.00,P<0.0001)、抵抗素样α(resistin⁃likeα,Retnla)(F=151.90,P<0.0001)、诱导型一氧化氮合酶(induc⁃ible nitric oxide synthase,iNOS)(F=107.80,P<0.001)、己糖激酶(hexokinase,HK)(F=9389,P<0.0001)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)(F=641.40,P<0.0001)、磷酸果糖激酶1(phosphofructokinase1,PFK1)(F=43.97,P<0.01)、葡萄糖激酶(glucokinase,GK)(F=432.50,P<0.0001)、丙酮酸脱氢酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinases,PDK1)(F=737.30,P<0.0001)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)(F=3632.00,P<0.0001)、葡萄糖转运体1(glucose trans⁃porter 1,GLUT1)(F=532.40,P<0.0001)、甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶(glyceraldehyde⁃3⁃phosphate dehydrogenase,GAPDH)(F=460.00,P<0.0001)、柠檬酸合酶(citrate synthase,CS)(F=5642.00,P<0.01)、糖原合成酶1(glycogen synthase 1,GYS1)(F=273.30,P<0.0001)、IL⁃6(F=1823,P<0.0001)、IL⁃10(F=291.70,P<0.0001)、IL⁃1β(F=986.60,P<0.0001)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)⁃α(F=334.80,P<0.0001)、转化生子因子(transforming growth fac⁃tor,TGF)⁃β(F=163.30,P<0.001)mRNA表达水平差异均有统计学意义。BMDM与多房棘球蚴PSC共培养组M2型巨噬细胞比例(22.87%±1.48%)高于M1型巨噬细胞(1.70%±0.17%)(t=24.61,P<0.001),BMDM与多房棘球蚴CF共培养组M2型巨噬细胞比例(20.07%±0.64%)高于M1型巨噬细胞比例(1.93%±0.25%)(t=45.73,P<0.001)。与对照组相比,BMDM与多房棘球蚴CF共培养组、BMDM与多房棘球蚴PSC共培养组M2型巨噬细胞标志物Arg1、Ccl22、Retnla mRNA表达水平均升高(P均<0.01),而M1型巨噬细胞标志物iNOS mRNA表达水平无明显变化(P>0.05),糖酵解关键酶HK、PK、PFK mRNA表达水平升高(P均<0.01),炎症因子IL⁃10、IL⁃1β、TNF⁃α、TGF⁃βmRNA表达水平升高(P均<0.01)。此外,与对照组相比,BMDM与多房棘球蚴PSC共培养组HK、PK、PFK蛋白表达水平,GLUT1、GAPDH、IL⁃6 mRNA表达水平均升高(P均<0.05);BMDM与多房棘球蚴CF共培养组HK蛋白表达水平升高(P<0.05);IL⁃4诱导组HK、PK、PFK蛋白及mRNA表达水平均升高(P均<0.01),IL⁃6、TNF⁃αmRNA表达水平均降低(P均<0.05),TGF⁃βmRNA表达水平升高(P<0.01)。糖酵解压力测试显示,对照组、IL⁃4诱导组、BMDM与多房棘球蚴PSC共培养组细胞外酸化率(extra cellular acidification rate,ECAR)差异有统计学意义(F=124.4,P<0.05);与对照组相比,BMDM与多房棘球蚴PSC共培养组ECAR增高,IL⁃4诱导组ECAR降低(P均<0.05)。结论多房棘球蚴CF/PSC处理使BMDM主要向M2型极化,糖代谢向高能量、高糖酵解代谢表型转变,并影响其炎症反应。

长角血蜱MESK基因的克隆及其生物学特性分析

为进一步了解MESK基因在长角血蜱免疫应答中的作用,克隆了长角血蜱MESK基因全长序列,采用有关生物信息学软件对该基因序列的一级结构进行了分析;构建了真核表达载体pEGFP-C1-MESK,采用脂质体转染法在HEK293细胞及HeLa细胞中对其进行了表达。48h后对细胞进行裂解,用兔抗长角血蜱阳性血清与表达出的重组蛋白进行反应,以检测重组蛋白的免疫活性。结果显示,MESK基因全长为1 426bp,包括1个1 185bp的开放阅读框。该基因含有5个N-糖基化位点、5个豆蔻酰化位点、9个酪氨酸蛋白Ⅱ激酶磷酸化位点、1个酪氨酸蛋白激酶位点、2个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、1个蛋白磷酸激酶C磷酸化位点。SDS-PAGE分析及Western-blot分析表明,表达出的重组蛋白的分子质量约为71ku,且以与兔抗长角血蜱阳性血清反应,免疫原性良好。结果表明,MESK基因可以作为一种重要的分子标记参与蜱分类的研究,在作为候选抗蜱疫苗的研究中具有重要的开发价值。

多房棘球蚴感染对巨噬细胞线粒体功能的影响

目的观察多房棘球蚴感染后巨噬细胞线粒体代谢功能变化,为探索多房棘球蚴病发病机制提供依据。方法根据处理方法不同设培养组和对照组,其中培养组按照500∶1比例将小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)与2 000个多房棘球蚴共培养,对照组RAW264.7细胞不做任何处理。根据培养时间不同,将对照组和培养组分为24 h对照组、72 h对照组、24 h培养组、72 h培养组。采用Mito Tracker;Deep Red FM线粒体深红色荧光探针标记线粒体并应用Cytation5细胞成像微孔板检测系统检测细胞线粒体平均荧光强度,用实时荧光定量PCR检测线粒体DNA拷贝数(mitochondrial DNA copy number,mt DNA-CN),采用Seahorse细胞能量代谢系统实时监测线粒体能量代谢功能,采用流式细胞术检测线粒体活性氧及线粒体膜电位。结果 24 h(15.341±2.532 vs. 17.823±3.429;t=6.379,P <0.01)、72 h(18.102±3.505 vs. 21.511±5.144;t=17.680,P <0.01)培养组线粒体平均荧光强度均较其相应对照组显著降低。72 h培养组mt DNA-CN(3.23×10^(9)±1.78×10^(7))较其对照组(4.39×10^(9)±3.70×10^(7))显著降低(t=8.85,P <0.001)。实时线粒体能量代谢功能分析结果示,24 h [(241.70±73.13) pmol/min vs.(69.05±52.30)pmol/min;t=7.89,P <0.01]、48 h [(249.50±42.06)pmol/min vs.(60.28±40.66)pmol/min;t=8.64,P <0.01]培养组较相应对照组细胞耗氧率升高,且48 h培养组细胞外酸化率较其对照组增高[(111.60±17.49) mp H/min vs.(35.05±7.57)mp H/min;t=16.90,P <0.01];72 h培养组较其对照组线粒体活性氧平均荧光强度显著升高(58 264±10 087 vs. 4 307±97;t=12.930,P <0.01)、线粒体膜电位显著降低(9.833%±2.285% vs. 2.667%±0.208%;t=6.645,P <0.01)。结论多房棘球蚴感染可损伤巨噬细胞线粒体功能、抑制巨噬细胞氧化磷酸化过程而使糖酵解增强,巨噬细胞代谢状态改变可能是多房棘球蚴病发生和发展的机制之一。