马氏珠母贝外套膜中央膜与边缘膜荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

为筛选能在马氏珠母贝外套膜边缘膜与中央膜区域稳定表达的内参基因,应用荧光定量PCR技术,对3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白(β-actin)、胆色素原脱氨酶(PBGD)、微管蛋白(TUB)、TATA盒结合蛋白(TBP)、磷脂酶A2(PLA-2)、葡萄糖苷酶(GUSB)、18S核糖体r RNA(18Sr RNA)等8个常用的内参基因在马氏珠母贝外套膜边缘膜与中央膜区域的表达情况进行分析,并利用ge Norm、Norm Finder、Best Keeper及Ref Finder软件对8个内参基因的表达稳定性进行分析。结果表明:8个内参基因均可获得特异性扩增产物,但稳定性各异,其在外套膜边缘膜和中央膜区的表达稳定性顺序依次为PBGD/TBP>TUB>GUSB>18Sr RNA>PLA-2>GAPDH>β-actin;在荧光定量PCR中,PBGD和TBP在马氏珠母贝外套膜边缘膜和中央膜区的表达比较稳定,为研究贝壳矿化机制中理想的内参基因。

马氏珠母贝SRF基因的分子特征及组织特异性表达

血清反应因子(SRF)是一个高度保守的转录因子,在细胞增殖、细胞凋亡以及免疫反应中发挥重要作用。为了探究血清反应因子在马氏珠母贝中的生物学功能,本研究运用c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到马氏珠母贝SRF基因(Pm SRF)c DNA的全长序列,并且应用实时荧光定量PCR技术对Pm SRF基因在马氏珠母贝不同组织中的表达进行检测。结果显示,Pm SRF基因序列全长1 758 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 440 bp,编码479个氨基酸,5'UTR为65 bp,3'UTR为253 bp,包含29 bp的poly A。预测其相对分子量为50 534.6 Da,理论等电点为7.71。多序列比对结果发现物种间SRF具有较高的保守性。SMART软件分析显示Pm SRF具有典型的MADS结构域。荧光定量PCR数据分析表明,Pm SRF基因在马氏珠母贝闭壳肌、肝胰腺、血细胞、外套膜、性腺、鳃六种组织中均有表达,其中在鳃中表达量最高。本研究可为进一步探究Pm SRF在贝类中的生物学功能提供重要的理论基础和参考价值。

马氏珠母贝LST8基因cDNA的分子特征及表达分析

LST8(lethal with SEC13 protein 8)是TOR(target of rapamycin)复合物的重要组成成分,在生物生长和发育的调控中发挥重要作用。本研究根据马氏珠母贝转录组数据库中注释为LST8的unigene序列设计引物,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得了马氏珠母贝LST8基因cDNA全长序列(pm-LST8);同时利用荧光定量PCR(Real-time PCR)技术检测了pm-LST8在马氏珠母贝各个组织中的表达含量。结果表明,pm-LST8基因cDNA全长1 350 bp,其中开放阅读框为948 bp,编码316个氨基酸残基,5'UTR为104 bp,3'UTR为298 bp,含有29 bp polyA。预测其分子量为35.4 kD,等电点为6.11。多序列比对显示pm-LST8与其它物种的LST8有较高的保守性,与牡蛎的同源序列高达82%。蛋白质结构预测显示pm-LST8具有典型的WD40结构域。荧光定量PCR分析表明pm-LST8在马氏珠母贝闭壳肌、鳃、外套膜、肝胰脏、性腺、足、血淋巴七个组织中均有表达,其中在性腺中表达量最高。本研究为进一步阐述LST8在马氏珠母贝生长和发育调控中的作用提供理论基础。

马氏珠母贝TOR基因cDNA的克隆与组织表达分析

TOR(target of rapamycin)是一类进化上非常保守的蛋白激酶,参与调节多种生化代谢,协调蛋白质的生物合成和降解。本研究采用c DNA末端快速扩增技术(RACE),克隆获得了马氏珠母贝TOR基因c DNA全长序列(pm-TOR);同时利用荧光定量技术检测了pm-TOR基因m RNA在马氏珠母贝各个组织中的表达含量。结果表明:pm-TOR基因c DNA序列全长9 220 bp,开放阅读框(ORF)长7 488 bp,编码2 495个氨基酸,5'非翻译区(5'UTR)长157 bp,3'UTR长1 575 bp。氨基酸序列同源比对分析显示pm-TOR氨基酸序列与其他物种具有较高的保守性,与牡蛎(Crassostrea gigas)的TOR的序列相似度为79%。荧光定量PCR数据分析显示,TOR基因的m RNA在马氏珠母贝血液、性腺、肝胰脏、外套膜、闭壳肌和鳃组织中均有表达,其中肝胰脏和性腺中表达量较高,血液中表达量较低。本研究为进一步阐述TOR在马氏珠母贝中生长和发育调控中的作用提供理论基础。