油菜素内酯提高玉米幼苗抗病性与Ca2＋分布的关系

为明确油菜素内酯(Brassinosteroid,BR)对Ca2+信使系统的影响及提高玉米抗病性的关系,为阐明BR提高玉米抗病性的机理提供理论依据。以玉米品种浚单20为材料,研究了BR处理后对玉米幼苗细胞中Ca2+分布的影响和玉米叶片对层出镰孢菌的抗性的变化情况。结果发现:BR处理后感病的叶鞘数目减少,病斑面积减小,细胞壁中Ca2+分布明显减少,细胞间隙中Ca2+分布明显增加,使得受侵染的部位比健康组织有更强的抗软化能力,抑制真菌的进一步侵染。

SSMP的结构解析及在拟南芥抗盐过程中的作用

【目的】解析SSMP(salt-sensitive membrane protein)的结构,明确SSMP的表达特性,预测和分析SSMP在拟南芥逆境胁迫过程中的作用。【方法】利用生物信息学方法,解析SSMP的结构特征;利用Real-time PCR技术分析SSMP的时空表达特性;利用SSMP-GFP融合技术转化拟南芥叶片原生质体,对SSMP进行亚细胞定位;构建SSMP的启动子连接报告基因GUS的表达载体,转化野生型拟南芥,通过染色方法观察报告基因GUS的表达情况,从而进行SSMP的组织定位分析;构建SSMP过表达载体,利用农杆菌侵染花絮法转化拟南芥,q RT-PCR技术验证过表达SSMP拟南芥阳性苗,分析过表达SSMP拟南芥的表型并进行抗逆性分析,明确SSMP的生物学功能;利用电导仪法比较过表达SSMP拟南芥和野生型拟南芥叶片的细胞膜透性,分析SSMP在拟南芥抵抗逆境胁迫过程中的作用。【结果】生物信息学分析表明,SSMP含有START(the lipid/sterol-binding St AR-related lipid transfer protein domains)保守域、共411个氨基酸,具有磷脂酰胆碱的结合位点,预测SSMP可能影响膜的组成。对SSMP的高级结构进行解析,SSMP含有9个反平行的β-折叠和2个α-螺旋,形成1个明显的疏水腔,N端的α-螺旋在疏水腔外,另一个α-螺旋形成疏水腔的盖子结构。Real-time PCR对拟南芥的不同组织及发育时期的SSMP表达量的分析表明,SSMP在拟南芥各组织中均有表达,表达量由高到低的顺序依次为茎生叶、莲座叶、茎、根、花和种子。SSMPpro::GUS转基因拟南芥幼苗的染色结果表明,在正常情况下,GUS主要在下胚轴、整个子叶和真叶的叶脉及表皮毛处表达;50 mmol·L-1 NaCl处理后,GUS在下胚轴和子叶中表达没有明显的变化,但在真叶中的表达减少;100 mmol·L-1 NaCl处理后,GUS的表达在下胚轴、子叶和真叶中都明显减少,子叶中GUS主要在叶脉处表达,在真叶中仅在顶端还有表达,这说明SSMP的表达受NaCl抑制。激光共聚焦显微镜488 nm波长下对SSMP-GFP的亚细胞定位进行观察,SSMP主要定位在细胞质膜上。过表达SSMP转基因拟南芥的细胞膜透性增加,不利于植物的抗逆性。进一步的萌发试验对过表达SSMP的转基因拟南芥的萌发率和转绿率进行了统计分析,结果表明,过表达SSMP明显抑制拟南芥种子的萌发。【结论】SSMP是具有磷脂酰胆碱结合位点的共411个氨基酸的蛋白质,含START结构域,主要位于细胞质膜上;在拟南芥各组织中均有表达,尤其在叶片中表达量最高,主要定位在整个子叶和真叶的叶脉及表皮毛着生处;SSMP的表达受盐胁迫的抑制;过表达SSMP的拟南芥细胞膜透性增加,耐盐性降低。

拟南芥PMRP的表达特性及功能分析

【目的】分析拟南芥中功能未知基因PMRP(putative membrane related protein)的表达特性;明确PMRP在调控拟南芥生长发育过程中的作用。【方法】利用生物信息学方法,寻找拟南芥中与PMRP含相同结构域的基因,并绘制进化树;利用Real-time PCR技术分析PMRP在生长8和21 d的拟南芥根、茎中的相对表达量,比较生长21 d的拟南芥第1、2、3、4对莲座叶及茎生叶中PMRP的表达情况,分析花器官的萼片、花瓣和雄蕊及生长后期拟南芥种子中PMRP的表达量的高低;构建35S::PMRP过表达载体,转化Columbia野生型拟南芥,通过RT-PCR技术验证PMRP的表达量,获得过表达PMRP的转基因植株;通过对过表达PMRP的转基因拟南芥的表型观察,分析PMRP对拟南芥叶片发生、茎的生长部位等的调控作用;通过对过表达PMRP转基因拟南芥茎秆横切面的石蜡切片观察,分析PMRP在茎秆维管束木质部和韧皮部分化过程的作用;通过对花器官的解剖学观察,明确PMRP对拟南芥花器官生长发育的影响;通过对过表达PMRP转基因拟南芥果荚形成的观察,分析PMRP对拟南芥育性的影响。【结果】PMRP是一个含有START保守域的411个氨基酸的蛋白质,具有跨膜结构域,在拟南芥中含有START结构的基因共35个;Real-time PCR结果表明,PMRP在茎生叶中表达量最高(相对表达量约为2 935)、莲座叶中次之,且莲座叶生长时间越长,PMRP的表达量越多(PMRP在第1、2、3、4对莲座叶中的相对表达量分别约为1 650、1 113、734、507),然后是花器官中的萼片(PMRP相对表达量约为937),PMRP在茎、根、种子中都有的表达,但相对表达量都低于270;PMRP在花器官中雄蕊的相对表达量最低(约为64),远远低于同属花器官的萼片中PMRP表达量(937),PMRP在根、茎中的表达量随生长时间的增加而增加,PMRP在8和21 d的根中相对表达量分别为154和222,PMRP在8和21 d的茎中相对表达量分别为200和264;过表达PMRP转基因拟南芥表现为在枝条上产生莲座叶,茎秆容易倒伏,维管束没有明显的形成层,且木质部和韧皮部排列紊乱,花器官中雄蕊的花丝变短,形成的角果数量减少,育性降低。【结论】START结构域在功能上极度保守;PMRP在拟南芥不同组织器官均有表达,且随着时间的延长,PMRP的表达量也增加,但在花器官的雄蕊表达最低,一旦过表达PMRP,拟南芥花器官的雄蕊发育异常,造成育性降低;PMRP对拟南芥的叶片发生、茎秆维管束分化和花器官发育具有重要作用。