猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立

基于猪圆环病毒2型(porcine circocirus type 2,PCV-2)的ORF2基因建立了一种便捷、灵敏而又特异的可视化环介导等温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。该方法通过针对PCV-2 6个位点的4条特异性引物,在Bst DNA聚合酶的作用下对PCV-2靶序列进行等温核酸扩增。经过对LAMP反应体系和反应条件的优化,所建立方法在61℃反应1 h能够成功的检测出PCV-2基因组DNA,且操作简单,不需要PCR仪等复杂仪器,结果可经电泳检测及肉眼观察;敏感性和特异性试验表明,所建立的方法能特异地检测PCV-2并且其敏感度可以达到0.5 pg的DNA分子;所建立LAMP方法的阳性检出率与国标PCR的阳性检出率符合度为100%。该研究为PCV-2的现场快速检测提供更加简便、快捷的方法,可以满足基层检疫的需要。

2008—2011年浙江省猪主要病毒性疫病病原流行病学调查

为了解浙江省猪主要病毒性疫病的流行动态,采集近4年来临床病猪病料1 118头份,采用PCR和RT-PCR方法进行猪主要病毒性疫病的病原检测。结果显示,PRRSV,CSFV,JEV,PCV2,PRV,PPV,PEDV和TGEV病原的平均感染率分别为51.71%,15.71%,27.16%,50.8%,1.99%,84.4%和9.0%。其中PRRSV,CSFV和PCV2每年都有较高的检出率,仍是浙江省猪场的主要病原;PRV和PPV近年来流行有所下降,该病已得到较好控制;2011年初发现流产病例中JEV的检出比例有明显升高,检出率高达39.29%;2011年2月在刚出生仔猪腹泻病例中PEDV检出率大大提高,造成严重损失。总之,浙江省猪场中PRRSV,CSFV和PCV2仍是防控的重点,但多病原感染或新变异株的出现也是近年来浙江省猪疫病复杂化的主要原因之一。

副猪嗜血杆菌CDT亚基原核表达及其抗原性鉴定

为原核表达副猪嗜血杆菌(H.parasuis)CDT毒素并检测其在体外培养时的分泌表达情况,本实验将切除信号肽的CDT毒素的3个亚基基因分别克隆于pET-28a载体中在大肠杆菌进行表达,并将重组蛋白经亲和层析纯化后,免疫兔制备抗血清,用于鉴定H.parasuis体外培养时CDT分泌表达情况。结果表明CDT毒素3个亚基均在Rosetta菌株中得到表达,其中cdtB约为28.2 ku,符合预期大小,而cdtA和cdtC亚基比预期的23.5 ku和17.4 ku略大。表达的3个重组蛋白可以被自然感染猪血清识别,表明其具有良好的反应原性,同时也表明H.parasuis在猪体内定殖或感染过程中分泌CDT。制备的抗血清可以与体外培养H.parasuis的分泌蛋白中的CDT亚基反应,表明重组蛋白具有良好的免疫原性,同时也表明H.parasuis体外培养时也分泌CDT。

副猪嗜血杆菌不同分离株CDT基因序列测定及其遗传变异分析

CDT毒素是多种革兰氏阴性致病菌的毒力因子。为了阐明CDT毒素在副猪嗜血杆菌不同菌株中的分布及其遗传变异情况,本试验对从浙江省不同地区猪场临床发病猪中分离到的41个副猪嗜血杆菌分离株进行了CDT基因PCR扩增,并对其中21个分离株CDT 3个亚基进行了基因测序及氨基酸序列分析。结果表明:所有41个临床分离株中都可以检测到CDT 3个亚基的基因,其中cdtA蛋白的氨基酸序列在不同副猪嗜血杆菌菌株中最为保守,同源性≥97.8%;cdtB及cdtC蛋白氨基酸序列变化较大,同源性均≥92.1%。其中cdtB亚基与牛DNase I活性关键位点的氨基酸残基具有一致性,且这些位点的氨基酸残基在不同菌株中高度保守,可能对CDT诱导细胞凋亡的活性起着重要作用。为研究副猪嗜血杆菌CDT的生物学作用提供了新的信息。

猪流行性腹泻病毒（PEDV）荧光定量RT-PCR检测方法的建立

猪流行性腹泻是猪养殖业常见的疾病之一,此病多发生于每年12月至翌年2月的寒冬季节,在夏季也可发病,由猪流行性腹泻病毒引起。该病是一种接触性急性猪肠道传染病,以水样腹泻、呕吐和脱水为主要症状。各种日龄的猪均易感,年龄越小死亡率高,其中哺乳仔猪受害最为严重。该病70年代初首先发现于英国,我国从80年代初开始陆续有本病的报道,给养猪业造成了重大的经济损失。所以及早确诊对于该病的诊治显得尤为重要,因此建立一种快速、高灵敏度的鉴别诊断PED的方法是十分必要的。同常规PCR法相比,荧光定量PCR技术可靠性和特异性强,加之具有操作方便及耗时短等特点而广泛应用于多种传染病的诊断,如牛病毒性腹泻、猪瘟、禽流感、鸭瘟等的诊断。本研究拟根据Genebank数据库序列设计特异性引物,建立一种灵敏稳定的针对猪流行性腹泻检测的定量PCR方法,为猪流行性腹泻的快速诊断、检疫防疫及分子流行病学研究提供手段。

科学的猪肺部评分有效监控猪场呼吸道疾病

自2018 年非洲猪瘟进入中国并迅速传播,中国养猪业经历了恐慌、毁灭与扩张并存、拼内功求生存的阶段,新一轮的猪周期持续推进着猪场转型升级、健康养殖、增效降本。除了非洲猪瘟,不同猪场还面临着急性繁殖、消化、呼吸系统疾病的困扰,直接经济损失巨大,已引起高度重视。猪肺炎支原体(M.hyo)、胸膜肺炎放线杆菌(APP)等病原慢性感染可引起支气管肺炎、胸膜肺炎等呼吸道问题,虽然临床症状相对轻微,死亡率也较低,但却严重影响生长肥育猪的日增重和饲料转化率,增加治疗成本,最终影响猪场经济效益。

2022年中国部分屠宰猪肺部病变评估及结果分析

养猪生产过程中,猪呼吸系统容易发生疾病,特别在肺脏和胸膜,猪群临床表现出急性或慢性的呼吸道症状,给猪群的健康造成巨大的影响,也会给猪场带来巨大的经济损失。生猪屠宰过程中,通过对猪肺部检查可以对部分有特征性病变的疾病进行初步判定,尤其是猪肺炎支原体(M.hyo)和胸膜肺炎放线杆菌(APP)感染,而且可以进一步用权威的肺部病变评分方法对以上两种病原感染程度进行量化,从而帮助猪场为制定或调整相关疾病防控方案提供依据,或监测防控效果。本文旨在对国际常用肺部评分方法进行对比,并对CLP方法进行的流行病学调查进行结果分析。

猪圆环支原体二联疫苗临床免疫效果的评估

猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type2,PCV2)感染可导致种猪繁殖障碍以及生长育肥猪生长缓慢、日增重降低、料重比升高,并发其他疾病,导致死亡率增加等。猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,M.hyo)遍布世界上绝大部分养猪国家,是猪呼吸道综合征(PRDC)的原发性病原之一,可造成养猪生产严重的经济损失。疫苗免疫是控制这两种疾病的最重要手段,PCV2与M.hyo两种疫苗免疫时间接近,免疫持续期要求类似(越长久越好)。

屠宰场检查和肺脏病变评分在养猪生产中的应用

疾病监测和感染评估在养猪生产中的作用日益突出。科学有效的评估手段有助于疾病早期的诊断和兽医决策的快速响应,降低损失。猪场的免疫程序和用药计划的制定也需要建立在有效评估的基础,才可以不断回顾、升级和优化。近年来随着养猪技术的不断更新和实践探索,特别是在非洲猪瘟疫情的冲击下,众多兽医监测方法得到广泛应用,进一步推动我国养猪业的快速发展。

猪流行性腹泻的流行现状及防控策略

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种猪急性肠道传染病,两周龄以内的仔猪受其危害最为严重。本文介绍了猪流行性腹泻的流行现状、致病机理、疫苗研究进展以及防控策略,以期为本病防控提供参考。

猪主要DNA病毒多重二温式PCR检测方法的建立及初步应用

通过对GenBank发布的猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的核苷酸序列进行比对分析,找出PPV的VP2基因,PRV的gH基因和PCV2的ORF2基因的相对保守区域。利用生物学软件在保守序列分别设计高溶解温度引物,将常规三温式PCR过程中的退火与延伸合并为一步,通过对PCR反应条件的优化,确定最佳引物浓度、最佳聚合酶浓度、最佳退火温度以及最佳反应体积,建立了多重二温式PCR方法检测PPV、PRV和PCV2,其扩增的目的片断大小分别为PPV(142 bp)、PRV(300 bp)和PCV2(469 bp),从而节省临床检测时间,同时又能通过一个反应体系对PPV、PRV和PCV2 3种猪主要DNA病毒进行检测。用30份临床病料对本研究多重PCR技术和单项PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为95%以上。表明建立的多重PCR检测方法,具有高度特异、快速、敏感等特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。

浙江省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为了解2004-2009年猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的变异情况,从浙江省各个地区采集了109份临床疑似病料,共检测到61份ORF5基因阳性,经序列测定得到可比序列117个。在核苷酸序列分析中,发现2004-2005年PRRSV ORF5序列之间同源性为83.6%～99.3%,2006年同源性最高达98.3～99.2%,2008-2009年同源性又有所降低。在氨基酸主要位点分析中,分离毒株的非中和表位27～30位点与美洲株相比,2004-2006年大部分毒株的29aa由A29-V29,而2007-2009年大部分毒株的29aa又由V29-A29;在表位37～45aa中,所有39位点处由L39-I39;在表位80～197aa中,从2004-2009年185aa大部分都发生了变异,由V185-A185,第189位点由I189-L189。在蛋白生化特性分析中,发现与参考株VR2332(AY150564)和CH-1a(AY032626)相比,浙江省PRRSV-GP5蛋白的第100～106位亲水性、表面可及性明显增加,抗原性指数也有所提高,而与参考毒株JX-06-2-EU480750相似。该试验结果说明随着时间的推移,PRRSV ORF5基因发生明显的变异。