家蚕雌蛹及其卵巢脂肪酸丰度分析

研究使用气相色谱分析了家蚕雌蛹蛹体和卵巢中的脂肪酸丰度.结果显示,蛹化后的第1 d至第6 d,蛹体脂肪酸丰度的变化幅度小,第6 d至第9 d,蛹体脂肪酸丰度的变化幅度大.蛹化期间,主要脂肪酸丰度总体呈下降趋势,微量脂肪酸丰度呈上升趋势.卵巢脂肪酸丰度的变化幅度随发育递减.不同主要脂肪酸的变化幅度和方向各异,其中不饱和脂肪酸丰度增加,饱和脂肪酸丰度下降.微量脂肪酸丰度随发育明显下降,这表明微量脂肪酸与雌性生殖关联较小.蛹体和卵巢脂肪酸丰度的差异随发育逐渐缩小,至蛹化第6 d,卵巢中绝大部分的脂肪酸丰度与刚蛹化时有很大差异,但整体上与蛹体丰度相似,说明卵巢脂肪酸的积累依赖蛹体脂肪酸.蛹化后期,卵巢中丰度最高的α-亚麻酸出现下降,丰度次高的油酸明显增加,这可能与卵壳生成和卵子成熟有关;亚油酸在蛹化第6 d丰度差异最大,其在卵巢中的丰度显著增加并明显高过蛹体,表明卵巢具有为其发育以及卵子发生积累脂肪酸的特性.研究结果可为深入研究脂肪酸在家蚕和其他昆虫雌性生殖中的作用机制提供重要线索.

FSHR胞外区抗原的二级结构预测和B细胞表位预测

目的:分析卵泡刺激素受体(Follicle stimulating hormone receptor,FSHR)胞外区蛋白的二级结构,在线预测FSHR胞外区潜在的B细胞表位。方法:利用DNAStarProtein软件对FSHR胞外区蛋白的二级结构和表面特性进行分析,联合在线B细胞表位预测,预测FSHR胞外区蛋白可能的抗原表位。合成预测的B细胞表位肽,对其抗原性进行鉴定。结果:FSHR胞外区蛋白可能的抗原表位区域为17～34、42～44、116～122、142～147、179～193、239～241、266～270、279～282、288～307。选择4个区域合成肽段表位区域能与免疫抗血清发生抗原特异性反应。结论:应用多参数成功预测了FSHR胞外区蛋白抗原的B细胞表位。

人Eppin蛋白的基因克隆和原核表达

目的克隆人附睾蛋白酶抑制蛋白(epididymal protease inhibitor,Eppin)基因,构建原核表达载体,诱导其在大肠杆菌中表达,并鉴定重组蛋白的免疫学活性。方法采用RT-PCR克隆人Eppin基因,将其克隆到原核表达载体pMAL-c2X,并通过IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中表达。Amylose树脂预装柱层析法提纯重组蛋白,并用SDS-PAGE和蛋白印迹法鉴定。结果PCR扩增出396bp目的基因片段Eppin。工程菌pMAL-c2X-Eppin经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,Mr约为54000与预期的一致,重组蛋白用Amylose树脂提纯,纯化蛋白的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带。Western blot显示重组蛋白质有良好的免疫活性。结论获得了Eppin融合蛋白在原核系统中的稳定表达,为后续深入研究其抗生育功能奠定基础。

炎症消退障碍与动脉粥样硬化不稳定斑块形成

炎症消退是炎症过程的必经和自限阶段,以局部炎症细胞和促炎介质清除、组织修复以及炎症反应及时终止为特征。炎症消退功能不足,导致炎症慢性化和组织损伤加重,与多种炎症性疾病发生相关。动脉粥样硬化是严重威胁人类健康的疾病,近年研究发现其不稳定斑块形成与炎症消退障碍关系密切。在此,我们从巨噬细胞吞噬作用缺陷、炎症细胞凋亡障碍、巨噬细胞极化失衡以及炎症消退脂质介质作用不足等方面综述动脉粥样硬化进程中炎症消退障碍的机制,并展望促进炎症消退功能恢复来治疗动脉粥样硬化的新策略。

人Izumo蛋白的二级结构及B细胞抗原表位预测

目的:预测人Izumo蛋白的二级结构及B细胞抗原表位。方法:以人Izumo基因序列为基础,按Chou-Fasman和Gamier-Robson方法预测其编码蛋白的二级结构,采用Karplus-Schulz方法预测Izumo蛋白骨架区的柔韧性;按Kyte-Doolittle方法预测其亲水性、Emini方法预测蛋白质表面可能性及Jameson-Wolf方法预测抗原性指数。结果:Chou-Fasman及Gamier-Robson两种方法预测的结果均表明,Izumo蛋白含较多的α螺旋,蛋白第6～17、30～40、88～99、103～120、153～160、173～188、249～260、283～297、334～338和339～346区段可能是α螺旋中心,第21～25、198～200、245～248和320～323区段可能是β折叠中心。用Kyte-Doolittle、Emini和Jameson-Wolf方法分别对Izumo蛋白B细胞抗原表位进行预测结果表明,蛋白质第36～42、62～66、94～99、118～122、129～132、151～154、161～164、173～177、205～208、212～216、256～265、271～276、283～288、314～318和336～350区段附近很可能为B细胞表位优势区域。结论:该研究结果有助于确定Izumo蛋白的B细胞优势表位及发挥免疫避孕的活性部位。

FSHR胞外区基因片段的原核表达及多克隆抗体的制备

目的构建人卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)胞外区的原核表达载体,并用纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备抗血清。方法采用RT-PCR克隆人FSHR胞外区,将其克隆到原核表达载体pET32a(+),并通过IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中表达,所获得的包涵体蛋白通过Ni-NAT离子交换柱层析纯化重组蛋白,并用SDS-PAGE和蛋白印迹法鉴定。结果PCR扩增出1 047 bp目的基因片段,测序证实克隆的基因序列与GenBank中的FSHR序列相符。工程菌pET32 a(+)/FSHR胞外区经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,Mr约为58 000,与预期的一致。其表达形式为不溶性包涵体,此包涵体蛋白通过Ni-NAT离子交换柱层析纯化,纯化的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带。该蛋白免疫小鼠制备抗血清,抗体效价为1∶12 800,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合。结论获得了人FSHR胞外区融合蛋白及特异性多克隆抗体,为进一步研究FSHR蛋白的功能奠定了基础。

重庆地区家蚕微孢子虫遗传多态性分析

为探讨家蚕微孢子虫种内的遗传多样性,对本实验室保存的一株家蚕微孢子虫的SSUrDNA,rDNA-ITS,rDNA-IGS,Sec61β5′上游序列(Nb-IGS1)和Hsp705′上游序列(Nb-IGS2)进行了PCR扩增和序列测定.多重序列比对发现它们都存在着不同程度的多态性.其中rDNA-ITS和rDNA-IGS遗传多样性最为明显,序列中存在较大的差异区域,包括多碱基的插入或缺失、单碱基的转换和颠换;而对基因上游的调控序列分析发现,Nb-IGS1和Nb-IGS2序列中存在着少量的变异位点.结合GenBank中Nosema属微孢子虫的同源序列,分别构建rDNA-ITS和rDNA-IGS系统树,结果表明重庆地区家蚕微孢子虫遗传分化比较明显.研究表明家蚕微孢子虫种内存在遗传多样性.

细胞编码microRNA在轮状病毒复制中的作用及其表达谱分析

目的研究细胞编码miRNA在轮状病毒复制中的作用,并分析轮状病毒感染对于细胞编码miRNA种类及表达的影响,结合预测初步寻找具有重要功能的单个miRNA。方法首先,利用RNAi技术成功干扰MA104细胞中miRNA生成必须的Dicer酶,利用FFA法比较Dicer干扰组与阴性对照组感染后子病毒的滴度。然后,利用miRNA微芯片技术分析MA104细胞在2株轮状病毒SA11与Wa株感染后miRNA表达变化,通过聚类分析研究变化规律。结果干扰组MA104细胞的子病毒滴度显著增高。MA104细胞编码miRNA在2株轮状病毒感染后,约有200个miRNA有不同程度的变化。结合计算机预测,初步锁定miR-512-5p,miR-490,let-7c等10个miRNA可能在轮状病毒复制中具有功能。结论轮状病毒调节其感染细胞编码的miRNA的表达谱,反过来,细胞的Dicer及细胞编码miRNA影响轮状病毒复制。

胸腺肽α1体外刺激胃癌患者外周血单个核细胞对淋巴细胞亚群影响

目的观察胸腺肽α1(thymosin α1,Tα1)体外刺激培养胃癌患者外周血单个核细胞(peripheral blood mono-nuclear cells,PBMCs)对淋巴细胞亚群分化及分泌细胞因子谱的影响,分析Tα1对肿瘤患者免疫功能的影响。方法分离32例胃癌患者及18例健康自愿者PBMCs,50、10、1μg/mlTα1体外刺激培养2d;流式细胞仪检测CD4+、CD8+、CD4+CD25+Foxp3+T细胞百分比、CD4+/CD8+变化及分泌Th1/Th2细胞因子谱变化。结果 Tα1体外刺激PBMCs后,胃癌患者及健康自愿者的CD4+、CD8+T细胞水平及CD4+/CD8+比值均无明显变化;健康自愿者CD4+CD25+Foxp3+T细胞水平无明显变化,胃癌患者CD4+CD25+Foxp3+T细胞水平明显提高(P<0.05);1μg/mlTα1促进胃癌患者PBMCs分泌IL-1β、TNF-α,10μg/ml促进胃癌患者PBMCs分泌IL-6(P<0.05),健康自愿者PBMCs分泌细胞因子谱变化不明显(P>0.05)。结论 Tα1体外刺激胃癌患者PBMCs,提高CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞亚群水平,可能对肿瘤患者抗肿瘤免疫起抑制效应。

MiR-155在断奶期接力miR-146a介导肠上皮固有免疫耐受

目的哺乳动物新生期肠上皮高表达mi R-146a介导固有免疫耐受,本研究探讨mi R-146a下降后肠上皮继续保持耐受状态的分子机制。方法定量PCR分析肠上皮mi R-146a与mi R-155表达模式,体外实验比较二者激活的刺激强度差异;转染及免疫印迹实验分析mi R-155在肠上皮免疫耐受中的功能及其可能调控靶标;小鼠提前断奶实验分析影响mi R-155激活的关键因素。结果肠上皮mi R-146a在新生期高表达并在断奶期降至极低水平,mi R-155则在断奶期剧烈上调;肠上皮中mi R-155激活强度显著高于mi R-146a;肠上皮高表达的mi R-155通过靶向抑制TAB2、IKKε、NIK等抑制炎症应答而非促进炎症;肠上皮mi R-155激活表达与哺乳动物断奶时间相关。结论哺乳动物肠道发育中,mi R-146a与mi R-155在断奶期发生功能接力,依次在新生期和成年期介导肠上皮固有免疫耐受。

基于Eppin优势中和B细胞表位的新型DNA避孕疫苗的制备和鉴定

目的制备基于Eppin优势中和B细胞表位的新型DNA避孕疫苗。方法采用PCR技术扩增mIL-4和Eppin B细胞表位基因,将其克隆到真核表达载体pVITR02-mcs,构建双盒表达载体,并将双盒表达质粒转染CHO细胞,检测其体外表达;将双盒表达质粒DNA与具有穿膜活性的HIV-1 TAT49-57阳离子肽,通过正负电荷吸引原理,制备成模拟病毒颗粒样的疫苗,并以DNA阻滞试验、DNaseⅠ保护试验和扫描透射电镜对该疫苗进行鉴定。结果 RT-PCR和免疫印迹结果表明转染细胞中均有目的分子的存在,在电荷比为4的条件下,该疫苗能形成类似病毒样的颗粒。结论成功制备了基于Eppin优势中和B细胞表位的模拟病毒颗粒样疫苗,为进一步研究避孕效果奠定了基础。