武昌鱼肝线粒体DNA限制性内切酶酶解图谱与12S rRNA基因的初步定位

武昌鱼肝线粒体(mt)DNA经六种限制性内切酶BamHI,BgⅢ,BgⅡ,EcoRI,HindⅡHpall单酶完全酶解分別得到2,2,3,3,3和7个片段。用琼脂糖凝胶电泳测得各个酶解片段的长度和分子量,经计算该mtDNA长约16.6kb,分子量10.2×10~6道尔顿(dalton)。用七对限制酶双酶全酶解,构建出五种限制性内切酶图谱。以酵母线粒体15SrRNA基因为探针对武昌鱼肝mtDNA中的12SrRNA基因进行初步定位。

氧和葡萄糖对啤酒酵母细胞核基因pet54表达调控的研究

为研究氧和葡萄糖对ｐｅｔ５４基因表达的调控，构建了ｐｅｔ５４：：ｌａｃＺ融合基因，用于监测有呼吸的二倍体菌株中ｐｅｔ５４基因的表达．实验结果表明氧促进ＰＥＴ５４基因表达，葡萄糖阻遏ｐｅｔ５４基因表达．

啤酒酵母菌株V25T线粒体15S rRNA基因的一级结构分析

报道啤酒酵母菌株Ｖ２５Ｔ线粒体１５ＳｒＲＮＡ基因全长１６５１ｂｐ核苷酸序列，并与已发表的啤酒酵母其他四株菌株的线粒体基因一级结构进行了比较。

病理性近视的基因位点筛查

目的通过基因组扫描和家系连锁分析,对已知病理性近视相关位点进行筛查。方法收集符合常染色体显性遗传的病理性近视家系,选取330对微卫星标记进行基因组扫描,在显性遗传模式、基因频率0·0133和外显率100%的条件下,进行二点连锁分析和多点连锁分析。结果连锁分析在9个家系中均未发现连锁位点。第12号染色体上LODs最大0·773459,最小-8·121303,第18号染色体上LODs最大0·559933,最小-8·936928,排除了与已知病理性近视基因位点MYP2和MYP3连锁。结论我国病理性近视基因位点与国外报道不同,存在遗传异质性。病理性近视遗传模式可能不是单一的单基因常染色体显性遗传。

全反式维甲酸通过内质网应激诱导N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V受阻的人肝癌SMMC-7721细胞凋亡

目的初步探讨全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)诱导N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V(N-acetylglucosaminyltransferase V,GnT-V)表达受阻的人肝癌SMMC-7721细胞(AsGnT-V/SMMC-7721)发生凋亡与细胞中内质网应激的关系。方法利用RT-PCR检测ATRA处理前后AsGnT-V/SMMC-7721细胞中内质网应激关键分子GRP78(glucose regulated protein78)、XBP1(X box binding protein1)等的变化,并用West-ern blot检测ATRA处理前后AsGnT-V/SMMC-7721细胞中内质网应激相关凋亡途径中的重要分子CHOP(C/EBP homologus protein)、caspase-9、caspase-12以及caspase-3的变化。结果GRP78和XBP1的变化表明经ATRA处理后AsGnT-V/SMMC-7721细胞的内质网应激加剧了,而与内质网应激相关的凋亡分子CHOP、caspase-9、caspase-12以及caspase-3都发生了激活。结论ATRA诱导AsGnT-V/SMMC-7721细胞发生的凋亡与内质网应激有关。

全反式维甲酸抑制反义N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V转染的SMMC7721肝癌细胞蛋白激酶B的表达

目的探讨全反式维甲酸(ATRA)诱导反义N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V转染的SMMC 7721肝癌细胞(简称AS—GnT—V/7721)凋亡机制。方法用Hoechst染色检测ATRA诱导细胞凋亡情况,并应用Northern Blot和Western Blot检测ATRA诱导AS—GnT-V/ 7721细胞凋亡过程中bcl-2及蛋白激酶B(PKB)的表达。结果Hoechst 33258染色结果显示ATRA处理AS—GnT—V/7721细胞24h后,细胞发生凋亡。Western Blot检测发现,ATRA处理AS-GnT—V/7721细胞不改变bcl-2的表达,但抑制PKB蛋白表达。ATRA处理AS-GnT—V/7721细胞24h后PKB蛋白即明显降低(约为原来的32％),处理48h后PKB蛋白几乎检测不到。Northern blot检测发现,ATRA处理AS-GnT-V/7721细胞12h,PKB mRNA即有所下降,24h时PKB mRNA约为原来的48％,处理48h,PKB mRNA减少至原来的15％。而ATRA处理对照细胞,bcl-2及PKB表达均不变。结论ATRA诱导AS-GnT-V/7721细胞凋亡过程中PKB的表达下降,而bcl-2表达不变。提示,ATRA诱导AS—GnT-V/7721细胞凋亡可能是由于抑制PKB表达,而与bcl-2无关。

肝癌细胞N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V表达受阻与内质网应激之间的关系

目的:探讨N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V(GnTV)表达受阻与内质网应激之间的关系。方法:应用RNAi技术,构建GnTVsiRNA表达质粒,抑制GnTV的表达,用RTPCR和Westernblot检测内质网应激中的重要分子GRP78(glucoseregulatedprotein,葡萄糖调节蛋白)、XBP1(Xboxbindingprotein1,X盒结合蛋白1)和PERK[RNAdependentproteinserine/threoninekinase(PKR)likekinase,RNA依赖蛋白丝/苏氨酸激酶的类似激酶]的表达变化。结果:GRP78的mRNA和蛋白质表达量升高;XBP1的mRNA发生剪接,蛋白分子量从33×103(33kD)变为54×103;PERK蛋白发生磷酸化。结论:GnTV受阻可导致内质网应激。

超表达蛋白激酶B对SMMC7721肝癌细胞增殖和凋亡的影响

采用脂质体转染的方法 ,将含持续激活蛋白激酶B的真核表达质粒转染到SMMC 772 1肝癌细胞中 ,研究蛋白激酶B对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响 .用RNA印迹及蛋白激酶B测活鉴定 ,并获得稳定表达持续激活蛋白激酶B的细胞株 ,用MTT法、软琼脂克隆形成率及细胞周期测定等方法检测超表达蛋白激酶B的 772 1细胞增殖情况 ,结果显示超表达蛋白激酶B的 772 1细胞生长能力增强 ,软琼脂克隆形成率增高 ,S期细胞增多 ,p2 7Kip1表达下降 .用流式细胞术检测悬浮培养诱导的细胞失巢凋亡 ,发现超表达蛋白激酶B能抑制细胞失巢凋亡 .上述结果提示蛋白激酶B能促进肝癌细胞增殖 ,抑制细胞凋亡 .

全反式维甲酸抑制肝癌细胞β-连环素的表达

全反式维甲酸 (ATRA)是人肝癌细胞株SMMC 772 1的分化诱导剂 ,刺激细胞向正常方向分化 .为了研究ATRA诱导细胞分化的机制是否与 β 连环素 ( β catenin)有关 ,用终浓度为 1 0 μmol LATRA刺激SMMC 772 1 ,发现胞浆内β 连环素明显降低 .进一步实验证实 ,ATRA下调胞浆内β 连环素和诱导β 连环素的mRNA降低有关 .同时 ,ATRA处理基本不会对E 钙粘附素 β 连环素中的β 连环素的量产生影响 ,但能增强细胞凝聚力 .结果提示 ,ATRA对两种形式的 β 连环素的调节机制是不一样的 ,ATRA诱导细胞分化的机制和β 连环素有关 .

SMMC7721肝癌细胞蛋白激酶B活性增高可驱动有功能的上皮钙粘着蛋白到细胞表面(英文)

为了研究蛋白激酶B (PKB)对上皮钙粘着蛋白 (E cadherin)的调节 ,使用了用胰岛素处理的野生型SMMC 772 1细胞及稳定表达持续激活PKB的SMMC 772 1细胞株 (Gag PKB/SMMC 772 1) .用RNA印迹法和蛋白质印迹法检测细胞E cadherin表达 ,发现通过胰岛素刺激或在细胞中表达持续激活PKB从而增加PKB活性 ,不影响E cadherin的转录和蛋白质合成 ,但用流式细胞术和免疫荧光定位E cadherin ,则发现PKB活性增加能明显驱动E cadherin到细胞表面 ,从而导致部分通过E cadherin途径的细胞粘聚增加和细胞调亡的抑制 .因此 ,我们提供新的证据表明 ,增加PKB活性可驱动有功能的E cadherin分子到细胞表面 .

PKB的PH结构域在原核表达及其纯化和活性

目的 利用原核系统表达原癌基因丝苏氨酸蛋白激酶B(PKB)的PH结构域 ,为进一步研究其结构和功能奠定基础。方法 我们构建了PKB的PH结构域的表达质粒 ,在大肠杆菌中表达出PH结构域 ,并利用蛋白N端加入的组氨酸标签进行亲和层析及离子交换层析纯化蛋白。结果 在大肠杆菌中表达的PH结构域以包涵体形式存在 ,经变性和复性后成为具有天然构象的可溶性蛋白 ,经亲和层析和离子交换层析纯化的PH结构域具有与磷脂酰肌醇PI 4 ,5 P2 的结合能力 ,证明其具有生物学活性。结论 本方法成功表达纯化了PKB的PH结构域 ,可用作PH结构域结构和功能的进一步研究。

抑制肝癌细胞N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ表达导致细胞未折叠蛋白质反应

目的探讨N乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ(GnTⅤ)对细胞基因表达和功能的影响。方法用WesternBlot验证GnTⅤ的反义cDNA稳转的细胞株AsGnTⅤ7721(AsGnTⅤSMMC7721)中GnTⅤ表达,用基因芯片技术比较AsGnTⅤ7721与7721(SMMC7721)细胞的基因表达差异,同时用RTPCR和WesternBlot检测AsGnTⅤ7721细胞中未折叠蛋白质反应信号通路关键分子Bip和XBP1的表达变化。结果基因芯片检测到的AsGnTⅤ7721细胞中的基因表达变化表明,细胞中产生未折叠蛋白质反应。同时AsGnTⅤ7721细胞中未折叠蛋白质反应信号途径中的关键分子Bip的mRNA和蛋白表达升高,XBP1mRNA被剪接。结论GnTⅤ表达受阻能导致细胞产生未折叠蛋白质反应。

油菜细胞质雄性不育叶绿体DNA酶切比较研究

采用高离子强度法分离出不同细胞质雄性不育胞质油菜叶绿体，裂解制备并纯化叶绿体DNA，限制性酶切分析比较了不同材料的ctDNA限制酶谱。结果表明，利用EcoRI酶切4种胞质叶绿体DNA，产生的DNA限制片断分子量在7．0～3．0kb之间，有明显的差异。

1-脱氧甘露糖野尻霉素诱导人肝癌SMMC7721细胞发生内质网应激

目的探讨人肝癌SMMC7721细胞中1-脱氧甘露糖野尻霉素(1-deoxymannojirimycin,DMJ)对高尔基体中α-甘露糖苷酶Ⅰ活性的抑制作用与内质网应激的关系。方法人肝癌SMMC7721细胞经DMJ诱导后,用RT-PCR和Western blot检测内质网应激中的重要分子葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78)、X盒结合蛋白1(X box binding protein1,XBP1)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologus protein,CHOP)及caspase-12的表达变化。结果GRP78的mRNA和蛋白质表达量升高;XBP1的mRNA发生剪接,蛋白相对分子质量从33 000变为54 000;CHOP蛋白表达量上调;caspase-12剪切激活。结论DMJ可诱导SMMC7721细胞发生内质网应激。

表达5aG株狂犬病毒糖蛋白基因的重组痘苗病毒的构建及鉴定

采用同源重组的方法，将５ａＧ株狂犬病毒糖蛋白基因插入天坛株痘苗病毒基因组ＴＫ区段，置于痘苗病毒晚期启动子Ｐ１１控制之下，通过筛选，得到一株重组病毒ＶＶａＧ，实验结果表明：该株病毒可表达５ａＧ株糖蛋白基因，表达产物位于感染细胞膜表面，分子量６４×１０３，并可与抗狂犬病毒糖蛋白单抗特异结合，用ＶＶａＧ免疫小鼠，可诱导机体产生抗狂犬病毒中和抗体，抵抗致死剂量狂犬病毒的攻击，中和抗体滴度在免疫后１４ｄ达到高峰，为１５６０．

乌鳢肝5SrRNA的提纯及部分性质的研究

本文介绍一种简便、快速提纯小分子5 SrRNA的方法。即直接从去腺粒体的细胞中用酚法抽提小分子rRNA,然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和提纯5 SrRNA。所得纯制剂经超离心分析其S值为4.95。文中还讨论了有关得率的因素。

β-连环蛋白反义cDNA对肝癌细胞恶性表型的影响

目的 :探讨应用反义核酸技术降低细胞内 β 连环蛋白水平对人肝癌SMMC 772 1细胞恶性表型的影响。方法 :构建 β 连环蛋白反义cDNA重组质粒 ,转染人肝癌SMMC 772 1细胞 ,筛选 β 连环蛋白低表达株 ,研究其恶性细胞表型的变化。结果 :转染 β 连环蛋白反义质粒后 ,低表达 β 连环蛋白的SMMC 772 1中c myc基因表达降低 ,细胞形态向未转化方向变化 ,细胞生长受到抑制 ,软琼脂克隆形成率下降 ,细胞周期发生改变 ,G0 G1期增加 ,S期减少。结论 :降低 β 连环蛋白表达可显著抑制 772

Sulindac通过抑制Wnt通路诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡

目的初步研究Wnt通路及蛋白激酶B(PKB)在非甾体类抗炎药sulindac诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡过程的作用。方法利用流式细胞仪检测肝癌细胞7721的凋亡,利用Western blot检测caspase-9、PARP(poly ADP-ribose polymerase)等凋亡相关分子的剪切,β连环蛋白(β-catenin)及糖原合酶激酶3β(GSK3β)与蛋白激酶B(PKB)磷酸化水平的变化,利用RT-PCR检测β-catenin及c-myc的mRNA水平。结果sulindac能够诱导SMMC-7721细胞凋亡,显著降低β-catenin的蛋白水平,抑制GSK3β9位丝氨酸的磷酸化,同时促使caspase-9、PARP等凋亡相关分子发生剪切;β-catenin的mRNA水平未见变化;PKB的磷酸化水平未见降低,反而略有增高。结论sulindac能够通过抑制Wnt通路,促进β-catenin的蛋白降解,降低其蛋白水平,诱导SMMC-7721细胞凋亡,且该作用不依赖PKB活性的抑制。

肝癌SMMC-7721细胞中PKB对β-连环蛋白的调控

目的 探讨在肝癌SMMC - 772 1细胞中蛋白激酶B(PKB)对 β 连环蛋白 (β catenin)的调控作用。 方法用WesternBlot和RT PCR等研究在肝癌SMMC - 772 1细胞中激活或抑制PKB后 ,β catenin基因及蛋白水平的变化。结果 以H2 O2 活化PKB ,则SMMC - 772 1细胞胞质内游离的 β catenin水平明显升高 ,而与E cadherin结合的 β catenin水平没有变化 ,β catenin的mRNA表达也未见明显改变 ;用Wortmannin抑制PKB的活性 ,可使胞质内 β catenin的含量下降。 结论 肝癌SMMC - 772 1细胞中PKB可以调控胞质中游离的 β catenin ,这为深入研究 β

过表达α1,3-岩藻糖基转移酶Ⅶ通过增强p38MAPK信号通路抑制UVC照射诱导的人肝癌SMMC-7721细胞的凋亡

目的初步探讨α1,3-岩藻糖基转移酶Ⅶ(简称FUT7)在UVC照射诱导的人肝癌SMMC-7721(简称7721)细胞凋亡过程中的作用及机制。方法用RT-PCR检测转染pcDNA3-FUT7质粒的7721细胞及转染空质粒pcDNA3的7721细胞中FUT7基因的转录水平;用流式细胞仪检测细胞表面FUT7产物SLex的表达水平;利用DAPI染核计算UVC照射后细胞的凋亡比率;用结晶紫染色法测定细胞的存活率;利用Western blot检测Caspase3的剪切情况及p38MAPK、JNK1/2和ERK1/2的磷酸化水平。结果过表达FUT7能抑制UVC照射诱导的7721细胞凋亡,同时还增强了细胞中p38MAPK信号通路的活性,而用p38MAPK的特异性抑制剂处理则可削弱FUT7的抗凋亡作用。结论在UVC照射诱导的7721细胞凋亡过程中FUT7具有抗凋亡的作用,这种作用可能部分通过增强p38MAPK信号通路活性而实现。