延边地区布鲁菌bp26基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

布鲁菌病（brucellosis）是由布鲁菌引起的人兽共患传染病，家畜牛、羊、猪最常发生，且可传染给人和其他家畜，其特征是生殖器官和胎膜发炎，引起流产、不育和各种组织的局部病灶。本病广泛分布于世界各地，目前在我国人畜间仍有发生，给畜牧业和人类的健康带来严重危害[1]。

鹅细小病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为制备鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),利用浓缩的GPV免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术,经间接ELISA方法筛选和有限稀释法克隆后获得一株抗GPV单克隆抗体杂交瘤细胞株4B4。经鉴定,其McAb的重链为IgG1亚型,轻链为κ链。ELISA和Western blotting试验结果表明,获得的4B4株McAb可特异性的识别GPV和GPV-VP3蛋白,表明4B4株McAb识别的表位可能位于GPV VP3蛋白的保守区域。为进一步鉴定GPV的表位和GPV诊断试剂的研究奠定了基础。

小鼠抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备

采用杂交瘤技术,用纯化的鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)VP3蛋白免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体(mAb),经间接ELISA方法筛选和有限稀释法进行3次亚克隆后获得一株抗鹅细小病毒VP3蛋白杂交瘤细胞株(4E5)。经鉴定,该mAb为IgG1亚型,轻链为κ链。Western blot试验结果表明,获得的4E5mAb可特异性地识别鹅细小病毒VP3蛋白。本试验成功制备了抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体,为研究鹅细小病毒病诊断方法奠定了基础。

鹅细小病毒三种疫苗对Balb/c小鼠的免疫效果

为了研究鹅细小病毒灭活苗、亚单位疫苗、核酸疫苗3种疫苗对Balb/c小鼠的免疫效果,试验自制了这3种疫苗,对Balb/c小鼠进行3次免疫,应用间接ELISA方法测定体液免疫水平。结果表明:用小鹅瘟灭活苗、小鹅瘟VP3基因亚单位疫苗免疫Balb/c小鼠,在三免后第21天抗体的P/N值达到峰值,分别为8.21,3.56;小鹅瘟VP3基因核酸疫苗在三免后第28天,抗体的P/N值达到峰值,为2.09。说明这3种疫苗中小鹅瘟灭活苗对Balb/c小鼠的免疫效果最好。

鹅细小病毒单抗双夹心ELISA检测方法的建立

为建立鹅细小病毒(GPV)检测方法,本研究以免抗GPV IgG为捕获抗体,抗GPV单克隆抗体为检测抗体,通过方阵试验确定了兔抗GPV IgG最适包被浓度为16 mg/L,抗GPV单克隆抗体最佳工作浓度为10.8 mg/L,酶标二抗最佳稀释倍数为1:4 000,建立了检测GPV单抗双夹心ELISA方法,对GPV检测灵敏度达0.312 mg/L。用该法对延边某养鹅场疑似发生小鹅瘟病的252只病死鹅进行检测,结果阳性率为75.79%,与病毒中和试验方法的检测结果符合率达91.11%。本研究建立的单抗双夹心ELISA方法为GPV的检测和区域流行病学调查提供了一种简便快速的血清学诊断方法。

鹅细小病毒延边株VP1基因真核表达质粒构建及其在Vero细胞中的表达

根据GenBank已发表的鹅细小病毒(GPV)B株基因序列,设计并合成1对含有Xho I和BamH I酶切位点的特异性引物,以提取的GPV基因组DNA为模板,经PCR扩增得到了1 163 bp的目的片段,并将该片段克隆至pMD-18T simple载体中,再将其亚克隆至真核表达载体pVAX1中,构建重组表达质粒pVAX1-VP1。经PCR鉴定、酶切分析和序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。通过脂质体法将pVAX1-VP1转染Vero细胞,经间接荧光抗体检测,在Vero细胞表面可见特异性荧光。经RT-PCR扩增得1 163 bp的目的片段。该研究为GPV核酸疫苗的研制奠定了基础。

9个微卫星基因座在东北黑熊养殖群体中的遗传多样性研究

选取了黑熊的9个微卫星基因座(ABB1、ABB3、ABB4、ABB5、ABB6、ABB7、ABB10、ABB11、ABB12)进行遗传多样性研究。结果:东北黑熊养殖群体的9个微卫星座位共检测到60个等位基因,平均为6.67个;9个微卫星基因座的平均多态信息含量为0.589 7,其中6个微卫星基因座的多态信息含量(PIC)>0.5,9个微卫星基因座的平均观察杂合度、平均期望杂合度分别为0.536 3、0.625 2。由此证明,9个微卫星标记均具有高度多态性,可用于东北黑熊的遗传多样性分析。