推定铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶小亚单位的DNA结合能力检测

目的检测理论推定的铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶小亚单位(pap3p01基因)编码蛋白对特异性DNA的结合能力。方法通过PCR从噬菌体PaP3基因组扩增出pap3p01基因,克隆至表达载体pQE31,转化入大肠杆菌JM109后,IPTG诱导表达目的蛋白,超声裂菌后发现目的蛋白质H6-PaP3P01存在于上清中,进而利用Ni-NTA亲合层析纯化蛋白。利用PCR与酶切方法获取可能含有末端酶小亚单位结合位点的DNA片段,并对其3′端进行生物素标记。最后采用凝胶迁移率改变实验检测H6-PaP3P01的DNA结合能力。结果成功构建了pQE-PaP3P01表达载体,获得的融合蛋白H6-PaP3P01表达量较高且全部存在于菌体超声后的上清中。经亲和层析初步纯化及脱盐处理后,H6-PaP3P01可与263 bp特异性DNA片段结合。结论成功构建并表达了推定的PaP3末端酶小亚单位重组蛋白H6-PaP3P01,并且检测到了该蛋白质对特异DNA的结合能力,初步证实了理论推定的正确性,为完善PaP3噬菌体包装机制的研究奠定了基础。

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶大亚单位DNA结合能力的测定

目的检测铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶大亚单位与噬菌体基因组末端cos位点的结合能力。方法通过PCR扩增出末端酶大亚单位编码基因tls,经pMD-T18载体克隆至表达载体pQE31上,IPTG诱导表达,获得包涵体蛋白,用包涵体裂解液溶解包涵体,通过Ni-NTA亲和层析,分离出重组目的蛋白rTLS,透析复性后,与生物素标记的基因组末端cos片段进行结合反应,通过EMSA检测DNA滞后现象。结果成功构建了表达载体pQE-tls,获得了纯化的具有生物学活性的重组末端酶大亚单位rTLS,EMSA结果证实结合rTLS后的cos片段与无蛋白加入的对照组相比明显滞后。结论重组噬菌体PaP3末端酶大亚单位在体外可与基因组末端cos片段发生特异性结合,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。

噬菌体PaP3推定基因tls核酸内切酶活性的初步验证

目的对BLAST推定的铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的tls基因功能进行实验验证。方法采用PCR方法从噬菌体PaP3基因组扩增出tls基因,克隆至pMD18-T载体中,再经酶切纯化后将目的基因插入表达载体pQE31,转化入大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达目的蛋白,超声裂菌后收集包涵体,并用裂解缓冲液溶解包涵体蛋白。然后利用Ni-NTA亲合层析纯化蛋白,通过透析使H6-TLS复性。最后构建含有末端酶大亚基酶切位点的底物质粒pMD-cos,检测复性蛋白活性。结果通过上述方法,成功构建了pQE-tls表达载体,融合蛋白H6-TLS表达量占菌体总量的30%。同时成功构建了目的蛋白的底物质粒pMD-cos。经由亲和层析初步纯化及透析复性后,H6-TLS可检测出核酸内切酶的活性,能将底物质粒部分线性化。结论成功地获得了具有内切酶活性的H6-TLS融合蛋白,为tls基因的认证提供了实验证据,为进一步鉴定和利用该基因奠定了基础。

外排泵介导鲍曼不动杆菌耐药性的研究进展

目的鲍曼不动杆菌的多重耐药性问题日趋严重,该菌外膜上外排泵过表达是导致其耐药性的重要机制。详尽地研究多药外排泵的机制以及寻找阻断其功能的外排泵抑制剂,将为多耐药鲍曼不动杆菌的治疗开辟新的路径。本文就近年来鲍曼不动杆菌外排泵的研究现状进行综述,着重描述多药外排泵RND家族的耐药谱特征及其表达调控机制,同时,还阐述了MFS和MATE家族外排泵的研究进展。

噬菌体DNA的衣壳化及注入宿主细胞的机制

噬菌体能够对复制产生的DNA进行精确包装,并使基因组DNA在蛋白质衣壳内以非常稳定的形式存在。同时,噬菌体还能高效释放基因组核酸并将其注入宿主菌体内。这种奇特的生物学现象及其内在机制在各种生物物理技术的帮助下,被人类逐渐认识。冷冻电子显微镜和荧光显微镜的出现,使得从单个噬菌体颗粒水平来了解基因组DNA的释放和穿入过程成为可能。

医学生物技术专业基因工程教学的体会

为了讲好医学生物技术专业学生的基因工程课程，依据教学经验，从教学内容、教学方法以及课外教学等方面提出了一些教学体会和思考，通过改革教学内容，加强绪论的讲解，采用案例教学和读书报告等方法，并增加课外实践和见习等方式，可激发学生学习兴趣，提高教学效果。

行为主义与建构主义相结合的医学生物化学教学探索

为解决医学生物化学教师难教学生难学的现状,依托认知心理学理论,结合建构主义和行为主义各自的优势,对传统的医学生物化学的教学模式进行改革和探索。教学中依据课程内容特点,学生专业特点以及学习阶段特点三方面因素,合理应用认知心理学设计教学模式,教师引导学生进入课程主体,培养学生的主动参与自我构建,激发学生的学习兴趣,增强了学生的综合素质,切实提高了医学生物化学的教学质量,值得应用和推广。

铜绿假单胞菌噬菌体PaP2生物学特性的研究

目的 确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP2的形态与大小、裂菌特性、最佳感染复数、一步生长特性等基本的生物学特性。方法 电镜观察纯化噬菌体颗粒 ;制备PaP2噬斑 ,观察其特点 ;提取噬菌体感染的细菌基因组 ,用SmaⅠ酶切 ,通过脉冲场电泳观察酶切产物的带型特点 ;测定不同感染复数 ,培养 3 5h后细菌 噬菌体液中的噬菌体滴度 ;加入宿主菌及噬菌体使MOI =10 ,进行一步生长实验 ,在 0时刻和每隔 15min测定噬菌体滴度。结果 噬菌体PaP2头部直径约为 5 2nm ,无囊膜 ,有一短尾 ;噬斑雾状半透明 ,直径约 1～ 2mm ;被噬菌体感染的宿主菌基因组的SmaⅠ酶切产物带型 ,比未感染宿主菌的多出了 1条大于噬菌体基因组的片段 ;当MOI =10时宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高 ;绘制出了一步生长曲线。结论 PaP2属短尾噬菌体科 ,是溶原性噬菌体 ;最佳感染复数是 10 ;感染宿主菌的潜伏期是 75min ,裂解期是 90min ,平均裂解量是 3

铜绿假单胞菌噬菌体PaP1生物学特性的研究

目的 确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP1的形态大小、核酸类型、裂菌特性、最佳感染复数和一步生长曲线等基本生物学特性。方法 对CsCl梯度离心纯化后的噬菌体PaP1颗粒进行电镜观察;提取PaP1基因组核酸,通过限制性内切酶图谱分析其核酸类型;制备PaP1的单个噬斑,观察噬斑特点;按照感染复数(MOI)分别为0 0 0 0 1、0 0 0 1、0 0 1、0 1、1和10加入噬菌体纯培养液和宿主菌,3 7℃160r/min培养3 5h后测定噬菌体滴度;加入噬菌体及宿主菌使MOI =10 ,3 7℃温育15min后进行一步生长实验,于0时刻和每隔10min取样5 0 μl测定上清中噬菌体滴度。结果 PaP1噬菌体头部呈多面体立体对称,直径约70nm ,无囊膜,有一个约60nm长的尾;PaP1噬斑直径约2mm ,圆形透明;当MOI为0 0 1时PaP1感染其宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高;根据一步生长实验结果绘制出了一步生长曲线。结论 PaP1属于肌尾科裂菌性噬菌体,其基因组为双链DNA分子;最佳感染复数为0 0 1,感染宿主菌的潜伏期是2 0min ,爆发期是40min ,平均爆发量约为65。

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3生物学特性的研究

目的测定铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的最佳感染复数、一步生长曲线和吸附K值及交叉吸附K值等基本生物学特性。方法按照感染复数(MOI)分别为0·0001、0·001、0·01、0·1、1和10加入噬菌体纯培养液和宿主菌,充分裂解细菌后,测定噬菌体滴度;以MOI=10的比例加入噬菌体及宿主菌,进行一步生长实验;纯化PaP3颗粒,免疫家兔,获得抗血清,通过中和反应实验测定PaP3和其抗血清之间的吸附反应常数K值。同时,利用抗血清交叉中和试验确定本室分离的三株噬菌体之间的血清学关系。结果当MOI=0·001时PaP3感染其宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高;根据一步生长实验结果绘制一步生长曲线;通过血清交叉中和反应得出不同的吸附常数。结论PaP3最佳感染复数为0·001,感染宿主菌的潜伏期是20min,爆发期是60min,平均爆发量约为31,其抗血清反应的吸附常数K值为262。

教学方法改革在提高生物化学教学质量中的探讨

教学方法改革是本校推进人才培养模式转型的重要举措。生物化学是高校医学专业的必修课程,是进行教学方法改革的重要学科。为进一步提高生物化学教学质量,本研究在不同层次学生的生物化学教学中选择合适的教学方法,进行课堂教学方法改革,取得了理想的教学效果,从而为教学方法改革的应用积累了一定的经验。

难测序噬菌体基因组PaP1的大片段克隆及测序

目的采用大片段克隆策略对难测序铜绿假单胞菌噬菌体PaP1基因组进行克隆及测序。方法用限制性内切酶AatⅡ将噬菌体PaP1基因组DNA切成几个大片段,分别进行末端修饰后与线性化的大片段克隆载体pYLTAC7连接,将连接产物电转化感受态细胞,筛选阳性克隆进行测序。结果AatⅡ将PaP1基因组切成8个片段,通过大片段克隆共获得3个阳性克隆,测出插入片段大小分别为9 805、8 335 bp和3 465 bp,使该难测序基因组的测出量达到47 757 bp。结论大片段克隆策略能够克服鸟枪法测序的不足,将有望获得噬菌体PaP1的全基因组序列。

铜绿假单胞菌噬菌体PaP2的结构蛋白及其编码基因的研究

目的 :确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP2结构蛋白的构成及其编码基因。 方法 :CsCl梯度离心纯化噬菌体PaP2颗粒 ,SDS PAGE电泳 ,确定结构蛋白条带及其相对分子质量 ;然后电转印于PVDF膜上 ,用Edman降解法进行N端测序。根据所测的N端氨基酸残基序列在PaP2预测基因编码的蛋白质中检索 ,从而逆推其编码基因。 结果 :SDS PAGE显示PaP2含有 10条带 ,其中 1、3、4、5、8、9等 6条带的含量足以回收进行N端测序 ,测得N端氨基酸残基分别依次为 :Met Ile Glu Leu Gly、Ala Ile Ser Pro、Ala Arg Phe Ile Asp、Ser Val Tyr Ala Gly、Ala Ile Ser Arg Asn 和Ser Phe Ser Leu Gly。据此推论出它们的编码基因分别是ORF18340 2 3889、ORF4 4 19 6 4 19、ORF16 5 89 1832 2、ORF82 74 95 30、OrF15 70 8 16 6 2 5、ORF75 6 3 830 9。 结论 :噬菌体PaP2含有 10个结构蛋白 ,其中 6个主要结构蛋白的编码基因分别是orf 2 4、orf 8、orf 2 3、orf 12、orf 2 2、orf 11。

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组电转化宿主菌的条件初探

目的：研究将铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组DNA电转入其宿主菌并获得噬斑的基本条件。方法：以铜绿假单胞菌PA3作受体菌，将噬菌体PaP3基因组DNA通过电转化导入受体菌中，研究细胞生长状态、感受态细胞的制备方式、电场强度、DNA浓度和细胞密度等条件对转化效率的影响。结果：在含50μg／ml红霉素的LB培养液中培养宿主菌14—16h，以100mmol／L蔗糖溶液为介质，在25℃条件下制备感受态并使其浓度达到10μ／ml，电转参数为12kV／cm，300Ω，25μF，在此组条件下能获得较高的转化效率，最高可达2．1×10^3pfu／μg的DNA。结论：确定了一组电转条件，成功地将铜绿假单胞菌噬菌体完整基因组导入PA3中，并形成噬斑，为铜绿假单胞菌噬菌体的深入研究奠定了基础。

改革生物化学实验教学 提高学生综合素质

生物化学是医学院校学生的专业基础课,实验教学环节非常重要。它不仅是培养、训练学生的实验操作能力,分析问题、解决问题能力的重要环节,更是培养学生创新能力的重要途径。结合生物化学教学实际,通过改革实验内容和实验教学方法,同时开设设计性实验等加强学生操作技能和综合素质的培养,从而提高学生综合实验能力。

医学微生物课堂教学中建构主义理论的应用

为改变医学微生物学课堂教学中沉闷乏味以及学生积极性差的现象,以建构主义学习理论为指导,采用"情景创设-多模式结合-强调协作-总结归纳-促进迁移"的课堂教学模式,从根本上改变单向灌输式的课堂教学模式,充分调动学生的积极性和创造性,增强学生的综合素质,并切实提高医学微生物学的教学质量。

《医学微生物学》教学改革与思考

传统医学微生物学课堂教学中普遍存在沉闷乏味以及学生积极性差的现象。通过树立学生是主体,能力素质是核心的教学理念,我们从医学微生物学的课程特点出发,采用多种方法相结合的课堂教学模式,从一定程度上改变了单向灌输式的课堂教学模式,调动了学生的积极性和创造性,增加了学生的综合素质,并切实提高了医学微生物的教学质量。

对知识经济社会中高等职业教育的思考

高等职业教育面对知识经济新挑战、新机遇 ,必须增强适应性和前瞻性 ,突出其鲜明特色 ,在办学观念上来一个根本性的转变 ,以素质教育为目的 。