转基因油菜W-4 T-DNA旁侧序列分析与事件特异性检测

W-4是通过农杆菌介导法将fad2基因的反向重复序列表达框转入甘蓝型油菜Westar后获得的转基因高油酸油菜品系。本研究应用温度不对称PCR(TAIL-PCR)技术扩增获得转基因油菜W-4的T-DNA插入位点的左、右旁侧序列。其中右边界旁侧序列长度为290 bp,其碱基组成G+C含量为31.27%、A+T含量为68.73%;左边界旁侧序列长度为365 bp,其碱基组成G+C含量为32.6%、A+T含量为67.4%,表明该T-DNA整合在富含A/T区。依据左、右边界旁侧序列和转基因载体的T-DNA左右边界序列设计的2对特异性引物TLF/TLR和TRF/TRR,能从W-4基因组DNA中扩增出大小分别为485 bp和405 bp预期产物,而在其他转基因油菜、非转基因油菜的基因组DNA和空白对照中均无特异性扩增产物,据此建立了W-4的转基因事件特异性PCR检测技术。应用该检测技术可以从含有0.1%W-4基因组DNA的混合样品中扩增出特异产物,检测灵敏度达到0.1%。表明应用该技术可对W-4转基因事件进行特异性检测。

转基因甘蓝型油菜品系W-4高油酸性状遗传分析

为研究转基因甘蓝型油菜(Brassica napus L.)高油酸品系W-4的高油酸性状的遗传,用W-4(P1)及其野生型Westar(P2)为亲本,配置正反杂交组合,衍生获得F1、RF1、F2、RF2,B1、B2和RB1、RB2等世代群体。应用气相色谱定量分析方法,检测亲本及衍生世代群体成熟种子中油酸含量;同时,在苗期检测各个世代群体对卡那霉素(Kan)抗性的反应。结果显示:W-4种子中油酸平均含量为(85.10±0.73)%,Westar为(62.16±3.68)%;F1、RF1群体油酸平均含量分别为(77.55±1.30)%和(77.34±2.46)%,均表现为高油酸含量(≥69.5%),无细胞质效应;B1、RB1群体全部表现为高油酸(≥69.5%)。B2、RB2群体中,高油酸个体分别为55个和52个,低油酸个体分别为45个和48个,均呈1∶1分离(χ2=1.00,χ2=0.16);F2、RF2分离群体中,高油酸与低油酸个体呈3∶1分离(χ2=0.96,χ2=0.11)。表明,P1的高油酸性状受1对显性基因控制,呈孟德尔遗传,无细胞质遗传效应。此外,苗期Kan抗性检测结果表明,P1、F1、RF1、B1、RB1群体植株对Kan反应均表现为抗;P2对Kan反应表现为感;B2、RB2群体中抗、感植株呈1∶1分离,F2、RF2群体中抗、感植株呈3∶1分离。表明P1的卡那霉素抗性受1对显性基因控制。

RNAi沉默转基因油菜fad2基因表达的种子特异性分析

为研究RNAi沉默转基因油菜fad2基因表达的效果及其器官特异性,实时荧光定量PCR法分析比较了转基因油菜W-4与非转基因对照Westar开花后第7天、第14天、第21天、第28天的种子以及越冬期油菜根、茎、叶器官中的fad2基因的相对表达量。结果显示:对照Westsr种子中fad2基因的相对表达量随开花后的天数呈逐渐增加的趋势,但W-4种子中fad2基因的相对表达量在开花后第21天、第28天较对照Westar显著下降,降幅达到60%。说明转基因油菜W-4在种子发育过程中表达的fad2基因的dsRNA干扰了fad2基因表达。W-4与Westar在越冬期根、茎、叶器官中fad2基因的相对表达量基本一致,无显著性差异。脂肪酸组成分析结果显示:W-4种子中油酸平均含量达到81.5%较Westar增加了近15%,而多不饱和脂肪酸平均含量为5.25%,较Westar下降了近70%;但根、茎、叶中的脂肪酸含量二者无显著差异;结果表明转基因油菜中RNAi干扰fad2基因表达具有种子特异性,不干扰其它器官的fad2基因表达。研究还发现转基因油菜fad2基因表达下降的时期与napin基因表达时期同步,均始于开花后21d左右,表明目标基因的表达受napin启动子的准确控制。

转基因高油酸油菜T-DNA插入拷贝数及整合位点分析

为获得转基因高油酸油菜T-DNA插入拷贝数及整合位点相关信息,本研究应用地高辛标记的NPTII基因片段为探针,与经BamHI酶切的转基因甘蓝型油菜高油酸株系W-4的T2代单株的基因组DNA进行Southern杂交。结果显示:W-4的T2代单株的基因组含有一个T-DNA拷贝。用3到4个根据载体pCNFIRnos序列设计的嵌套特异性引物分别与简并引物组合进行TAIL-PCR反应,扩增得到转基因油菜T-DNA插入位点的左、右边界旁侧序列。经分析右边界旁侧序列长度为470bp,其中180bp为载体序列,290bp为W-4的基因组序列;左边界旁侧序列长度为641bp,其中365bp为W-4的基因组序列,276bp为载体序列。序列比对结果发现该转基因事件中,T-DNA左边界序列完全整合到油菜基因组中,仅有1个碱基由G转换成了A。而右边界则缺失了包括RBborder在内的62个碱基。结果表明:转基因高油酸油菜T-DNA的整合是一次无其他额外载体序列的整合。blast分析获得的与左右边界相连的油菜基因组序列,未检索到与之高度同源的序列,推测T-DNA插入位点可能位于油菜基因组非编码区。综上所述,本研究分析了转基因油菜W-4基因中T-DNA拷贝数、整合特点和旁侧序列,研究结果为转基因油菜的生物安全性评价以及转基因高油酸油菜的检测提供重要的基础信息。

转基因油菜W-4T-DNA旁侧序列分析与事件特异性检测(英文)

W-4是通过农杆菌介导法将fad2基因的反向重复序列表达框转入甘蓝型油菜Westar后获得的转基因高油酸油菜品系。为建立W-4的转基因事件特异性PCR检测技术,应用温度不对称PCR(TAIL-PCR)扩增获得转基因油菜W-4的T-DNA插入位点的左、右旁侧序列。其中右边界旁侧序列长度为290 bp,其碱基组成G+C含量为31.27%、A+T含量为68.73%;左边界旁侧序列长度为365 bp,其碱基组成G+C含量为32.6%、A+T含量为67.4%,表明该T-DNA整合在富含AT区。序列比对结果发现,该转基因事件中,T-DNA左边界序列完全整合到油菜基因组中,仅有1个碱基由G转换成了A。而右边界则缺失了包括RB border在内的62个碱基。结果表明:转基因高油酸油菜T-DNA的整合是一次无载体序列的整合。依据左、右边界旁侧序列和转基因载体的T-DNA左右边界序列设计了2对特异性引物TLF/TLR和TRF/TRR,能从W-4基因组DNA中扩增出大小分别为485和405 bp的预期产物,而在其他转基因油菜、非转基因油菜的基因组DNA和空白对照中均无特异性扩增产物,据此建立了W-4的转基因事件特异性PCR检测技术。应用该检测技术可以从含有0.1%W-4基因组DNA的混合样品中扩增出特异产物,检测灵敏度达0.1%。可对W-4的转基因事件进行特异性检测。

利培酮治疗首发精神分裂症的疗效及对患者心肌标志物水平的影响

目的观察利培酮治疗首发精神分裂症的临床疗效,并探讨其对患者心肌标志物水平的影响。方法回顾性分析2015年8月至2018年2月期间中牟县人民医院收治的100例首发精神分裂症患者的临床资料,根据治疗方法不同将其分为对照组和观察组各50例。对照组采用常规抗精神药物氯丙嗪治疗,观察组采用利培酮治疗,比较两组患者治疗12周后的临床疗效以及治疗前后的心肌标志物[肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)、谷草转氨酶(AST)、可溶性细胞间黏附分子-1(s ICAM-1)]水平,同时比较两组患者治疗期间的药物不良反应发生情况。结果治疗12周后,观察组患者的治疗总有效率为92.0%,明显高于对照组的66.0%,差异有统计学意义(P<0.05);治疗12周后,观察组患者的CK-MB、CK、AST、s ICAM-1水平分别为(12.75±2.20)U/L、(69.34±3.02)U/L、(23.01±3.02)U/L、(50.73±5.02)ng/L,明显低于对照组的(15.24±4.61)U/L、(83.21±3.68)U/L、(24.15±3.12)U/L、(68.87±5.35)ng/L,差异均有统计学意义(P<0.05);治疗12周期间,观察组患者的药物不良反应总发生率为4.0%,明显低于对照组的20.0%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论利培酮治疗首发精神分裂症可改善患者的心肌标志物水平,提高生活质量,临床疗效较好,值得临床推广应用。