重组CRM_(197)-4GnRH去势疫苗抗原分子的原核表达及免疫效果评价

通过大肠杆菌表达系统对CRM_(197)-4GnRH重组去势疫苗抗原进行表达,采用不同种类佐剂制备疫苗,研究其对大鼠的免疫去势作用,为获得1种免疫效果好、有效期长、生产成本低的促性腺激素释放激素(GnRH)免疫去势基因工程疫苗提供借鉴。采用白喉毒素无毒突变体(CRM_(197))与4拷贝GnRH串联,将CRM_(197)-4GnRH基因与表达载体连接,并通过优化试验确定大肠杆菌的最优表达条件,用SDS-PAGE和Western blot鉴定目标蛋白的表达情况。将融合蛋白与不同佐剂乳化,制备成9种测试疫苗后分别免疫大鼠,测定血清中GnRH抗体滴度和睾酮浓度。结果显示,重组大肠杆菌的最优表达条件为诱导时间表达5 h,培养基为LB液体培养基,IPTG诱导浓度为0.5 mmol/L;通过SDS-PAGE和Western blot试验,表明目标融合蛋白已成功表达;动物试验结果表明,重组疫苗水包油包水佐剂组、重组疫苗油包水佐剂组、GnRH+Th抗原(辅助型T细胞抗原)表位(G1抗原)油包水佐剂组测试疫苗免疫大鼠较其他组GnRH抗体滴度显著升高、睾酮浓度显著下降(P<0.05),表明这3种疫苗具有良好的免疫去势作用。研究结果为GnRH免疫去势疫苗的研制奠定了基础。

基于辅酶调控产9α-OH-AD工程菌株构建及其发酵工艺优化

利用偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)MFT降解植物甾醇生产9α-羟基-雄烯二酮(9α-OH-AD)过程中,存在丙酰辅酶A过量积累及辅因子不平衡等问题,影响菌株的转化效率。通过表达scpC降低胞内丙酰辅酶A含量,并通过串联表达ndh解决植物甾醇侧链降解过程中胞内辅因子I不平衡的问题,在此基础上表达AarC将琥珀酰辅酶A和乙酸盐转化为琥珀酸盐和乙酰辅酶A,增强三羟酸(TCA)循环。构建的重组工程菌株MFT-scpC-AarC-ndh经初步优化发酵后,9α-OH-AD产率达到89.56%,比原始菌株转化率提高了37.86%。本研究为9α-OH-AD的工业化生产提供了理论基础和技术支持,也为其他植物甾醇转化工程菌株的构建提供新策略。

生物医药类专业学位研究生育人模式的探索

专业学位研究生教育具有应用性和职业性的基本特征,在满足生物医药产业对既具有扎实理论基础又能解决行业实际问题的高层次和高质量应用型人才的需求方面具有显著优势。天津科技大学从课程体系和教学方式、培养模式和师资队伍建设、学位论文选题和管理、考核评价体系等方面,探索生物与医药专业学位研究生育人模式,全过程实现人才“应用性和职业性”特征的强化。

高产9α-OH-AD偶发分枝杆菌的诱变选育及其转化工艺优化

偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)作为重要的9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)生产菌株,在甾体药物的生产中起着重要的作用。为了进一步提高偶发分枝杆菌的9α-OH-AD生产水平,对原始菌株进行常压室温等离子体(ARTP)诱变处理。在最佳诱变处理时间(35 s)下,筛选得到一株高产9α-OH-AD的诱变株Mycobacterium fortuitum AR-2。当投加10 g/L植物甾醇时,转化96 h,该菌株9α-OH-AD摩尔生成率达87.6%,较原始菌株提高14.9%。进一步,对AR-2进行ARTP-LiCl复合诱变,确定最佳LiCl诱变浓度为3.5%,得到一株高产9α-OH-AD的诱变菌株Mycobacterium fortuitum#91。当RM-β-CD添加量与底物摩尔比为1:1,投加10 g/L植物甾醇时,该菌株9α-OH-AD摩尔生成率达95.7%,较原始菌株提高34.9%,具有良好的应用前景。

羟丙基-β-环糊精对植物甾醇侧链生物转化反应的影响

研究了转化介质对分枝杆菌(Mycobacterium sp.NRRLB-3683)降解植物甾醇生物转化反应的影响。结果表明添加羟丙基-β-环糊精构建成一种新的超分子介质体系可以提高转化反应的反应速率和摩尔转化率,当植物甾醇质量浓度为5g·L-1,转化168h时植物甾醇摩尔转化率达到89.9%,较对照试验提高了3.1倍。在含有羟丙基-β-环糊精的转化体系中,研究了羟丙基-β-环糊精添加量、添加时间和底物质量浓度对植物甾醇生物转化反应的影响。研究表明,植物甾醇质量浓度为5～10g·L-1,转化0h时添加与植物甾醇摩尔比为2:1的羟丙基-β-环糊精,转化72h,底物摩尔转化率达到85%以上。本研究为环糊精超分子主体化合物在甾体生物转化反应中的应用提供了理论依据和基础数据。

反应介质对植物甾醇侧链生物降解的影响

分析考察了有机溶剂、表面活性剂和超分子等反应介质对分枝杆菌(Mycobacterium sp.NRRLB-3683)降解植物甾醇生成雄甾烯酮AD(D)的生物转化反应的影响.结果表明,采用有机溶剂和吐温80等表面活性剂作为反应介质的转化反应的转化率较低,而在含有环糊精的超分子反应介质中植物甾醇的转化率和转化速率均大幅度提高.采用直接添加的方式加入羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD),反应168h,植物甾醇转化率达89.8%,比对照提高了2.9倍.转化48h时加入与植物甾醇摩尔比为2∶1的HP-β-CD,72h时转化率达到87.5%,此时同期对照转化率为27.6%,缩短了反应周期.

宏基因组学技术分析传统食醋发酵过程微生物多样性

传统食醋具有悠久的历史,生产工艺独特,酿造过程中复杂的微生物群落及其代谢产物赋予了传统食醋独特的风味。采用宏基因组学技术对天津独流老醋醋酸发酵过程中细菌群落组成及其多样性进行分析。结果表明:在醋酸发酵前期细菌具有较高的多样性,主成分分析表明与醋酸发酵过程相关的细菌为乳杆菌属(Lactobacillus)、醋杆菌属(Acetobacter)和念珠藻属(Nostoc)。随着醋酸发酵的进行,醋酸菌的含量呈增加趋势,乳酸菌的丰度降低,在整个醋酸发酵过程中乳酸菌的丰度远远高于其他细菌,说明乳酸菌可能对食醋的风味形成具有重要作用。

赭曲霉转化洋地黄毒苷的工艺优化和产物活性分析

以赭曲霉Rn405转化洋地黄毒苷的微生物转化工艺为研究对象,对助溶剂种类、底物浓度、金属离子种类和浓度等关键参数进行优化,确定的最优转化条件为:发酵培养基中添加1 mmol/L Mn2+离子,28℃,180 rpm振荡培养28 h时加入溶解于DMSO的底物溶液,使其终浓度为100 mg/L,然后在相同的条件下转化96 h。此时,底物的转化率和11α-羟基洋地黄毒苷元的生成率分别达到了100%和25.4%,比优化前分别提高了33.1%和14.5%。通过斯氏灌流法和Langendorff灌流法,探讨两个转化产物对蟾蜍和大鼠心肌细胞收缩能力的影响。结果表明,洋地黄毒苷元对心肌细胞收缩率的影响和底物洋地黄毒苷相当,而11α-羟基洋地黄毒苷元对心肌细胞收缩率的影响比底物洋地黄毒苷和洋地黄毒苷元均有所增强。

基于细胞性质分析不同有机溶剂对简单节杆菌C1,2脱氢反应的影响

通过对简单节杆菌细胞性质的研究,探讨了不同有机溶剂(乙醇、DMF、DMSO、甲醇)加入后醋酸可的松生物转化反应效率产生差异的原因。采用底物转化法检测生物转化率,采用平板活菌计数法计算细胞存活率,通过糖代谢活力保留值表征细胞的生理代谢活力,用原子力显微镜观察细胞超显微结构,以FDA法表征细胞膜通透性。在体积分数为4%的条件下,4种有机溶剂均能提高简单节杆菌生物转化醋酸可的松的初始转化速率和最终转化率,转化率从高到低依次为乙醇>DMSO>甲醇>DMF;4种溶剂对简单节杆菌存活率和糖代谢活力保留值的影响趋势基本一致,其中DMF最大,DMSO次之,乙醇和甲醇较小;4种溶剂中,甲醇对简单节杆菌细胞完整性的影响最大,乙醇次之,DMF和DMSO差别不明显;4种有机溶剂对简单节杆菌细胞膜通透性的影响大小依次为甲醇>乙醇>DMSO>DMF。上述结果表明,细胞生理代谢活力和细胞膜通透性的差异是造成转化率水平不同的重要原因。其中,细胞膜通透性的增强有利于底物分子更容易进入细胞与生物酶接触,进而提高转化率。

有机溶剂对大肠杆菌细胞膜的影响

通过对甲苯、四氯化碳、正己烷、邻苯二甲酸二乙酯4种有机溶剂对大肠杆菌K12存活率、细胞膜电位、通透性和脂肪酸组成的影响研究发现:大肠杆菌对正己烷、邻苯二甲酸二乙酯耐受性较对四氯化碳和甲苯的耐受性强;在有机溶剂刺激下,可以看到细胞膜电位的降低及细胞膜通透性的增加,细胞膜饱和脂肪酸比例增加.在加入0.3%四氯化碳30min后,细胞膜电位下降了16.3%,通透性增加34.5%,饱和脂肪酸比例达到38.7%.因此,大肠杆菌通过细胞膜的变化来适应有机溶剂的刺激.

紫红红球菌9α–羟化酶loop对酶活性的影响

3–甾酮–9α–羟化酶是转化雄甾–4–烯–3,17–二酮生成9α–羟基雄甾–4–烯–3,17–二酮的关键酶,其加氧酶组分在底物进入酶活性中心入口处,存在一个由16个氨基酸构成的柔性loop.为了明晰loop对酶活性的影响,利用定点突变技术对loop上结构变化较大的氨基酸进行研究,解析出了各氨基酸的作用,T224、N225、Y226与周围α5螺旋和β折叠存在一定相互作用,共同调节底物通道与底物运送能力;D227和D228起到支撑固定loop结构的作用,使T224–Y226能与其周围的氨基酸产生相互作用.这为进一步采用蛋白质工程改造9α–羟化酶提供了理论依据.

生物制药工艺学课程教学模式的多元化探索

生物制药工艺学是制药工程及其相关专业的一门阐述药物生产基本规律的必修专业理论课。课程是对生物学、医学、药学、生物技术、化学和工程学等多门学科的基本原理和研究方法的深度融合和综合性应用,因此,具有"学科间相互关联度高""理论紧密联系实践""工程思想鲜明"等特点。针对这些特点,本文设计自我学习和课堂学习、理性学习和感性认知、启发教学和翻转课堂相结合的多元化教学模式,在实际教学中取得了良好的效果。

一株分枝杆菌降解胆固醇制备AD(D)的转化条件

通过分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)M3限制性降解胆固醇侧链获得了产物雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)。优化了胆固醇的投料时间、投料方式、培养基初始pH和葡萄糖浓度等工艺参数。将羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)应用于转化反应中,确定了HP-β-CD的最佳添加时间和添加量,使AD(D)生成率由初始对照的30%提高到60%,转化至72 h时AD(D)生成率达48%,是同期对照的4.0倍,生成率与生成速率均得到显著提高。在添加HP-β-CD的最佳转化条件下,AD(D)生成率达到70%,是初始对照的2.3倍。

抗逆元件及其在高效微生物细胞工厂构建中的应用进展

微生物作为重要的细胞工厂,其应用时经常面临的各种胁迫条件严重制约细胞活力和生产性能。大量文献证明,微生物的胁迫耐受性是受到胞内多个代谢途径和生理系统调控的复杂表型。那么,挖掘和应用增强菌株胁迫耐受性的抗逆元件是构建高效微生物细胞工厂的有效手段。目前,已报道的微生物抗逆元件主要包括调控细胞壁和细胞膜、DNA修复、氧化应激、相容性溶质、能量产生和信号转导的相关基因以及外排泵、热激蛋白和全局转录因子等。着重介绍了近年来抗逆元件及其在高效微生物细胞工厂构建中的应用实例,同时,讨论了实际应用中可能面临的机遇与挑战。

气相色谱法测定植物甾醇发酵液中雄甾烯酮和植物甾醇的含量

采用气相色谱仪建立了一个同时测定植物甾醇发酵液中雄甾-4-烯-3，17-二酮（Androst-4-ene-3，17-dione，4-AD）、雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮（Androst-1，4-diene-3，17-dione，ADD）和植物甾醇含量的外标分析方法．发酵液经离心后，二氯甲烷提取，可直接进样分析．气相色谱条件为：FID检测器，SE-54型（15m×0．25mm×0．25gm）毛细管柱；柱温260℃，进样口和检测器温度均为300℃；载气为高纯N2，流速1mL／min．在实验条件下，发酵液中各主要成分和杂质分离良好．结果表明：4-AD、ADD和植物甾醇各组分的浓度与Ai／As的线性范围4-AD为0．5-4g／L（R=0．9999）；ADD为0．5～4g／L（R=0．9992）；菜籽甾醇为0．09～0．86g／L（R=0．9991）；菜油甾醇为0．14～1．39g／L（R=0．9995）；豆甾醇为0．03～0．27g／L（R=1）；谷甾醇为0．24～2．4g／L（R=0．9991），平均回收率4-AD、ADD和上述植物甾醇依次为（96．37±0．77）％，（95．64±1．01）％，（99．6±278）％，（9866±2．19）％，（96．85±2．19）％，（97．52±2．9）％．该方法具有步骤简单、重现性好、准确度和灵敏度高的特点．

生防枯草芽孢杆菌B579补料分批发酵工艺优化

本论文对生防枯草芽孢杆菌B579补料分批发酵工艺进行了优化,提高了菌体浓度和最终芽孢浓度,为生防菌剂的大规模生产奠定了基础。为获得较高的最终芽孢浓度,分别优化了葡萄糖补加时机、浓度控制范围以及发酵过程pH。利用7 L发酵罐,当葡萄糖浓度降至3.0 g/L时开始连续补加葡萄糖至3.0-6.0 g/L,发酵过程控制pH为7.0,培养24 h菌体浓度达到3.9×1010CFU/mL,继续培养至40 h芽孢浓度达到2.8×1010CFU/mL,分别是分批发酵的7.5倍和7倍。发酵过程葡萄糖浓度对菌体生长和芽孢形成有较大影响,过高的葡萄糖浓度会抑制芽孢的生成,发酵过程控制合适的葡萄糖浓度有利于菌体浓度和芽孢浓度的提高。

赤红球菌CGMCC3090生物转化肉桂腈合成肉桂酰胺的工艺

针对目前肉桂酰胺工业生产采用的肉桂酸和二氯亚砜、浓氨水两步化学反应工艺存在安全性较低、产物分离纯化困难等问题,建立并优化了赤红球菌CGMCC3090催化肉桂腈生成肉桂酰胺的转化工艺.研究表明:底物肉桂腈浓度为1.5,mol/L,赤红球菌菌体质量浓度为2.6,g/L,在30,℃、pH 7.5条件下,转化5,h后转化率可达100%,具有产物纯度高、无副产物肉桂酸生成的优势,为赤红球菌CGMCC3090生物转化合成肉桂酰胺的工艺放大和生产性应用奠定了良好基础.

赭曲霉对16α,17α-环氧黄体酮的C_(11)α-羟基化工艺研究

研究了赭曲霉对16α,17α-环氧黄体酮(EP)的C11α-羟基化工艺条件。考察了接种量、摇床转速、底物投料方式及投料时间等工艺参数对转化率的影响,初步确定最佳转化工艺条件如下:转化培养基初始pH值为5.0、接种量为2.0%、摇床转速为200 r.min-1、28 h时投加乙醇溶解的EP、EP浓度为10 g.L-1,此条件下转化率达80.5%。将羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)应用于转化反应中,在转化反应进行4 h时添加与EP摩尔比为1.25∶1的HP-β-CD,转化率达到93.1%,较未添加HP-β-CD的转化率提高了12.6%。

HP-β-CD对脂质体和真核细胞通透性的影响

以薄膜水化法制备的阴离子脂质体的平均粒径为(180±2.3)nm,Zeta电位为–33.9,mV.分别以脂质体中钙黄绿素的泄露量和紫外分光光度法测定蛋白含量,以表征羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)对脂质体和真核微生物蓝色犁头霉(Absidia coerulea)细胞通透性的影响.结果表明:在HP-β-CD作用下,两者的通透性变化趋势一致.分析比较HP-β-CD作用下的甾体化合物17,а,21-二羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮(RS)在脂质体和菌体细胞中的通量变化的相关性,表明脂质体与细胞通量变化的拟合度达到97.9%,相关性显著(P<0.05).由此说明,本研究建立的脂质体制备方法以及获得的脂质体能够模拟真核细胞,应用于真核微生物的生物学研究.

简单节杆菌发酵液中羟丙基-β-环糊精含量HPLC法分析

羟丙基β环糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin,HP-β-CD)的特殊结构使其能作为主体包结疏水性甾体,提高甾体的溶解度,同时作为底物/产物储存库,降低底物/产物毒性,添加到发酵液中提高了底物的转化率.利用高效液相色谱法对简单节杆菌发酵液中HP-β-CD的含量进行定量分析.采用Luna NH2100,A(4.6,mm×250,mm,5,μm)色谱柱,流动相为乙腈-水(V乙腈∶V水=60∶40),流量1.0,mL/min,RID示差折光检测器,进样量20,μL.结果表明:HP-β-CD的浓度在2～18,mmol/L的范围内线性关系良好(R=0.999,9),羟丙基-β-环糊精平均回收率(n=9)为99.35%(RSD=0.57%).通过对发酵液中羟丙基-β-环糊精的含量分析证实,该方法具有快速、操作简便、准确、精密度好等特点,适应用于发酵液中羟丙基-β-环糊精的分析.