犬细小病毒VP2基因的克隆与生物信息学分析

本研究旨在克隆犬细小病毒VP2(Canine parvovirus VP2,CPV-VP2)基因,构建克隆载体pMD18-T-VP2,分析其生物信息学特征。以犬细小病毒(CPV)阳性病犬血液基因组病毒DNA为模板,PCR扩增CPV-VP2基因,通过TA克隆获得pMD18-T-VP2重组质粒,测序后对其进行生物信息学分析。结果表明:(1)CPV-VP2完整的开放阅读框由1755个核苷酸组成,共编码585个氨基酸残基,其序列同源性与浣熊最高,达97.6%;(2)信号肽在线预测认为,CPV-VP2基因无信号肽;(3)CPV-VP2大多数氨基酸偏好以T、A结尾的密码子;(4)CPV-VP2蛋白可能存在7个糖基化位点,其丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸分别存在8个、10个和7个磷酸化位点;(5)CPV-VP2可能存在76个B细胞抗原表位;(6)CPV-VP2蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构;(7)CPV-VP2蛋白二级结构的α-螺旋区域占9.93%、β-折叠区域占24.49%、无规则卷曲区域占65.58%;(8)CPV-VP2蛋白三级结构存在多个螺旋和折叠区域,主要以无规则卷曲为主。本研究为制定CPV-VP2基因原核或真核高效表达策略提供了参考资料,并为进一步制备CPV胶体金快速诊断试纸条和基因工程疫苗奠定了基础。

山羊Klf4基因克隆、原核表达和His-Klf4融合蛋白纯化

旨在克隆山羊Klf4基因,构建重组质粒pET30a-Klf4,通过原核表达技术获得纯化的His-Klf4融合蛋白。从山羊的生殖脊中提取总RNA,用RT-PCR的方法扩增Klf4基因编码区序列,通过TA克隆构建pMD18-T-Klf4重组质粒。酶切鉴定与测序分析后将Klf4的cDNA亚克隆至pET-30a载体,构建重组质粒pET30a-Klf4。酶切鉴定后将其导入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测确认,镍离子金属螯合亲和层析法纯化His-Klf4融合蛋白。结果表明:(1)从山羊生殖脊中克隆了Klf4基因,其开放阅读框由1 434个核苷酸组成,编码478个氨基酸,而且该序列与绵羊的同源性最高,达到98.5%;(2)经过SignalP 4.0在线分析,Klf4的编码蛋白不存在信号肽;(3)经SDS-PAGE和Western blotting分析表明,重组质粒pET30a-Klf4在大肠杆菌中得以表达;在变性条件下纯化,获得了His-Klf4融合蛋白。

人心肌红蛋白多肽单抗原表位基因的克隆、原核表达及抗体制备

目的本研究以原核表达单抗原表位的人心肌红蛋白(MB)肽段,制备不同表位的多克隆抗体。方法利用软件分析人心肌红蛋白的抗原表位,获得4个肽段(片段1、2、3、4);PCR扩增其基因序列,连接到表达载体p ET-GST,转化至E.coli BL21进行诱导表达。结果 GST-Sepharose 4B亲和层析柱进行MB-GST融合蛋白纯化,获得Mr28 000左右的融合蛋白,质量浓度为15 mg/L。免疫新西兰大白兔获得高效价的多克隆抗体。结论 4种多肽抗体均具有较好的特异性。

低碳经济时代我国外经贸发展策略研究

一、低碳经济的概念、发展以及影响 （一）低碳经济概念及其发展状况 1．低碳经济的概念 低碳经济最早是由英国政府提出的，旨在依靠技术创新和政策创新，实施一场能源革命，建立一种能够较少排放温室气体的经济发展模式，从而减缓气候变化。