巨噬细胞PDHA1基因敲除对非酒精性脂肪性肝病小鼠肝细胞凋亡的影响

目的:探讨巨噬细胞丙酮酸脱氢酶E1 α1亚基(pyruvate dehydrogenase E1 subunit alpha 1), PDHA1在同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)中对肝细胞凋亡的作用。方法:随机选取6周龄体重相近的PDHA1基因正常野生型小鼠和巨噬细胞特异性PDHA1基因敲除(PDHA1^(iΔMΦ/iΔMΦ))小鼠各12只,均分别给予普通饮食和高Hcy饮食喂养12周后用于后续实验。应用琼脂糖凝胶电泳技术对PDHA1^(iΔMΦ/iΔMΦ)小鼠进行基因鉴定;Western blot检测两种基因型小鼠骨髓巨噬细胞PDHA1蛋白表达;使用全自动生化分析仪检测小鼠血清Hcy和丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)水平;试剂盒检测肝组织上清液甘油三酯(triglyceride, TG)和ALT水平;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色观察小鼠肝组织结构改变;qRT-PCR和Western blot检测小鼠肝组织中凋亡相关指标Bax和caspase-3的mRNA和蛋白表达。结果:PDHA1^(iΔMΦ/iΔMΦ)小鼠均表达Lyz2-Cre及PDHA1-flox,且巨噬细胞中PDHA1蛋白表达减少(P<0.05),表明巨噬细胞特异性PDHA1敲除小鼠模型构建成功。高Hcy饮食组PDHA1^(iΔMΦ/iΔMΦ)小鼠血清Hcy水平升高(P<0.05),表明高Hcy血症模型构建成功。高Hcy饮食组小鼠肝组织上清液TG和ALT水平显著升高(P<0.05),且巨噬细胞中PDHA1敲除后,血清及肝组织中ALT水平升高更为显著。HE染色结果表明,高Hcy饮食使小鼠肝脏发生脂肪变性,巨噬细胞中PDHA1基因敲除可加重肝细胞的变性坏死。PDHA1^(iΔMΦ/iΔMΦ)组凋亡相关指标Bax和caspase-3表达均显著升高(P<0.05)。结论:抑制小鼠巨噬细胞中PDHA1表达,可促进高Hcy饮食诱导的NAFLD小鼠模型中肝细胞的凋亡,这可能是加重NAFLD肝损伤的其中一个机制。

铁死亡参与高蛋氨酸饮食诱导ApoE^(-/-)小鼠肝损伤的发病过程

背景:高同型半胱氨酸可以通过氧化应激、炎症反应和内质网应激等机制促进肝损伤的发生。高蛋氨酸饮食诱导的E型载脂蛋白基因敲除(ApoE^(-/-))小鼠可以引起肝损伤以及体内同型半胱氨酸水平升高,铁死亡是一种依赖于细胞内的铁并引起脂质过氧化物过量蓄积的细胞调节性死亡途径。然而,它是否参与了高蛋氨酸饮食诱导肝损害的形成需进一步研究和探讨。目的:探讨铁死亡在ApoE^(-/-)小鼠高同型半胱氨酸致肝损伤中的作用。方法:12只6-8周龄雄性ApoE^(-/-)小鼠,体质量20-25 g,随机分为对照组和高蛋氨酸组,每组6只,分别采用普通饲料和高蛋氨酸饲料喂养13.5周。喂养结束后通过病理学观察以及肝组织中天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶活性检测评估小鼠肝损伤情况;组织铁检测试剂盒测定小鼠肝组织中的铁离子含量;通过肝组织中丙二醛含量和荧光强度评估小鼠肝组织中脂质过氧化程度;实时荧光定量PCR与Western blotting方法分别检测两组小鼠肝组织中P53和谷胱甘肽过氧化物酶4的mRNA和蛋白表达水平。结果与结论:①与对照组相比,高蛋氨酸组发现大量肝细胞排列紊乱,间隙增大,胞浆疏松的典型肝损伤组织病理学改变;天冬氨酸转氨酶以及丙氨酸转氨酶活性升高(P<0.01);肝组织中铁离子含量增加(P<0.01),丙二醛含量(P<0.01)及荧光强度均增加;②实时荧光定量PCR与Western blotting检测发现,高蛋氨酸组小鼠肝组织中谷胱甘肽过氧化物酶4的表达水平降低(P<0.01),P53的表达水平升高(P<0.05);③提示铁死亡参与高蛋氨酸饮食诱导ApoE^(-/-)小鼠肝损伤的发病过程。

血管内皮细胞PDHA1基因特异性敲除鼠构建及其表型功能鉴定

背景:PDHA1基因是有氧呼吸链中不可或缺的基因,血管内皮细胞的能量代谢与很多疾病有关。构建血管内皮细胞PDHA1基因敲除鼠,有助于研究能量代谢在血管内皮细胞相关疾病中的作用。目的:繁育血管内皮细胞PDHA1基因特异性敲除小鼠并进行表型鉴定。方法:将PDHA1^((iΔEC/iΔEC))小鼠与PDHA1^((iΔEC/-))小鼠进行合笼繁育,获得更多的PDHA1^((iΔEC/iΔEC))小鼠进行后续实验。利用PCR和琼脂糖凝胶电泳进行基因鉴定,然后利用RT-PCR和Western blot检测敲除PDHA1后与能量代谢相关基因的mRNA及蛋白表达,利用VE-Cadherin与PDHA1双重免疫荧光判断PDHA1基因条件性敲除后PDHA1蛋白表达变化。结果与结论:利用琼脂糖凝胶电泳实验成功检测出子代小鼠基因型,包括PDHA1^((iΔEC/iΔEC))15只和PDHA1^((iΔEC/-))2只小鼠;RT-PCR和Western Blot检测发现PDHA1在转录水平和翻译水平都发生了下降,参与糖酵解途径的HK2蛋白及mRNA表达上升,参与有氧磷酸化途径方向IDH蛋白及mRNA表达下降;VE-cadherin和PDHA1双重免疫荧光共染色检测到PDHA1的表达下降。

过表达HGF基因AAV9型腺相关病毒载体的构建与鉴定

目的构建稳定表达肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)基因重组腺相关病毒过表达质粒载体,制备并纯化HGF过表达的高滴度重组腺相关病毒。方法合成HGF基因并利用PCR扩增,退火形成双链,与pAAV-ITR-CMV质粒经XhoⅠ单酶切连接构建质粒pAAV-ITR-CMV-AAV9-HGF,转化至大肠杆菌DH5α,提质粒后经酶切和测序鉴定证实重组质粒克隆正确,将重组质粒转染至293FT细胞中包装为腺相关病毒。小鼠注射病毒后通过Western blot法评价HGF的蛋白表达水平。结果扩增产物包含HGF CDS全序列的2186 bp,酶切结果与测序结果说明PCR扩增HGF目的片段成功;实时荧光定量PCR检测结果显示,纯化后所得的过表达HGF的腺相关病毒滴度为5.22×10^(12) vg·mL^(-1);HGF过表达组HGF蛋白相对表达含量较生理盐水组与阴性对照组均升高(P均<0.01)。结论本研究成功构建了HGF腺相关病毒载体且病毒滴度达到普通动物注射要求,证明腺相关病毒载体构建成功。

铁死亡在煤尘诱导小鼠煤工尘肺形成中的作用

[背景]煤工尘肺(CWP)是一种危害严重的职业病,铁死亡是一种细胞程序性死亡方式,它是否参与了煤尘诱导CWP的形成须进一步探讨。[目的]阐明铁死亡在煤尘诱导小鼠CWP形成中的作用。[方法]C57BL/6J小鼠被随机分为生理盐水组和CWP模型组,每组8只。采用气管滴注法造模,分别予以0.1 mL生理盐水或煤尘悬液0.1mL(50 g·L^(–1))经气管注入。通过HE染色和Masson染色评价CWP模型组小鼠肺部损伤及纤维化情况;铁离子检测试剂盒检测小鼠肺部铁离子浓度;分别检测丙二醛(MDA)浓度和荧光强度、谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)值评价小鼠肺部脂质过氧化情况;通过Western blotting和实时荧光定量PCR评价谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX_(4))、铁蛋白的mRNA和蛋白表达水平。[结果]CWP模型组小鼠肺部正常结构受损,肺泡壁厚度增加,出现炎症细胞浸润,胶原蛋白沉积较生理盐水组明显增加。CWP模型组小鼠肺组织铁离子质量浓度[(10.75±5.42)mg·L^(–1)],较生理盐水组[(1.14±0.37)mg·L^(–1)]增加(P<0.01)。CWP模型组小鼠肺组织MDA浓度[(37.32±12.18)μmol·L^(–1)]较生理盐水组[(18.70±8.22)μmol·L^(–1)]增加(P<0.01)。CWP模型组鼠肺组织MDA荧光强度高于生理盐水组。CWP模型组小鼠肺组织GSH/GSSG值(1.50±1.70)较生理盐水组(4.95±2.86)降低(P<0.01)。CWP模型组小鼠肺组织GPX_(4)、铁蛋白的mRNA相对表达水平(14.29±7.21、106.70±36.70)均较生理盐水组(38.84±15.61、225.90±54.34)降低(均P<0.01),同时GPX_(4)、铁蛋白的蛋白相对表达水平(0.92±0.22、0.97±0.09)也均较生理盐水组(1.47±0.54、1.73±0.34)降低(均P<0.05)。[结论]铁死亡可能参与了煤尘诱导小鼠CWP的形成。