海洋真菌Aspergillus candidus HM5-4次生代谢产物的研究

目的 对海绵共附生真菌Aspergillus candidus HM5-4的次生代谢产物及其生物活性进行研究。方法 综合运用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱以及半制备型高效液相色谱等分离技术对该菌株的大米发酵产物进行分离纯化;通过波谱数据和理化常数分析,并结合文献数据比对,鉴定化合物的结构;分别采用滤纸片法和MTT法对所分离鉴定的化合物进行抗菌和细胞毒活性测试。结果 从A. candidus HM5-4的发酵产物中共分离鉴定10个化合物,其结构分别为:氯黄菌素(1)、4"-deoxyterphenyllin(2)、蓟黄素(3)、asperterphenyllin(4)、prenylcandidusin(5)、2,4-二甲氧基-1,10-二羟基对联三苯(6)、(±)-2-羟基-3-苯基丁酸(7)、candidusin A(8)、candidusin B(9)和aspergivone(10),其中化合物7为新的天然产物。生物活性测试结果显示,化合物1对火龙果溃疡病原菌有很强的抑制作用,当供试浓度为10.0μg/disc时,其抑菌圈直径为(41.67±2.36) mm;化合物8对白血病细胞K562、肝癌细胞BEL-7402、胃癌细胞SGC-7901、肺癌细胞A549和宫颈癌细胞Hela有一定的细胞毒活性,其IC_(50)分别为(17.51±0.11)、(31.45±0.11)、(32.27±0.20)、(77.43±0.26)和(68.88±0.57)μmol/L,化合物2对白血病细胞K562具有细胞毒活性,其IC_(50)为(94.58±1.21)μmol/L。结论 海绵共附生真菌A. candidus HM5-4具有生产抗菌、细胞毒活性先导化合物的潜在研究价值。

番茄钙依赖性蛋白激酶基因LeCPK2在热(光)胁迫中的功能鉴定

钙依赖性蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases,CDPKs or CPKs)作为一类钙感知蛋白在植物的生长发育和胁迫应答中起着重要的作用。LeCPK2(GenBank accession No.:GQ205414)是我们从番茄中分离的第3个CDPK基因,前期研究表明LeCPK2可能在植物热胁迫应答中发挥作用。为了进一步研究其在热胁迫中的功能,我们通过电子克隆的方法分离了LeCPK2的启动子序列,并通过LeCPK2过表达烟草分析其在高温胁迫中的潜在的功能。生物信息学分析显示,LeCPK2启动子中包含5个热响应元件,和前期试验结果一致。野生型植株在受到热胁迫后,对光更为敏感,强光照下植株叶片发生萎蔫,而强光本身不会对未受热胁迫的健康植株造成伤害。LeCPK2转基因植株热、光胁迫后不会出现受害表型。以上研究表明,LeCPK2在植物的热胁迫应答中发挥重要作用,能够有效保护植株免受高温胁迫的损害,是一个优秀的耐热(光)基因。本研究将为揭示番茄LeCPK2遗传功能及对其开发利用奠定基础。

苦荞过敏蛋白TB22的原核表达及纯化

为了确定苦荞主要过敏原蛋白TB2 2的抗原决定簇 ,揭示其致敏机制 ,为以后的分子改造及育种改良打下基础 ,需要在体外微生物体系中获得大量的纯化蛋白。以pQE 31为表达载体 ,M1 5为表达菌株 ,使用IPTG诱导 ,在 37℃获得了以包涵体形式存在的表达产物。经WesternBlotting检测 ,证明表达条带N端带有Histidinetag。使用 8mol L尿素初步纯化后 ,目的蛋白含量达到 40 %以上。进一步HitrapChelatingHP亲和纯化 ,表达蛋白的纯度达到 90 %以上。建立了适合重组TB2 2纯化的基本方法 ,得到了纯化的包涵体 ,为抗TB2 2抗体的制备及其抗原决定簇的研究奠定了基础。

硫氧还蛋白抗体柱的制备

目的:探索硫氧还蛋白(Trx)抗体柱对Trx融合蛋白纯化的可行性。方法与结果:对含有Trx基因的质粒表达载体pTrxFus进行改造,在Trx读框之后加入6×His序列,并在大肠杆菌中表达C端带有6×His标签的Trx,经Ni2+柱亲和纯化后制备多克隆抗体;把经蛋白A纯化后的抗体偶联在溴化氰活化的琼脂糖凝胶上,制成Trx抗体柱;用此抗体柱纯化与Trx融合表达的豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI),SDS-PAGE结果显示获得了纯度较高的Trx-CpTI。结论:用Trx抗体制成的免疫亲和层析柱可以有效纯化Trx融合蛋白。

一种苦荞主要过敏原基因cDNA的克隆及序列分析

为了获得苦荞中主要过敏原的cDNA和由此推导的蛋白质序列 ,分析其结构特点 ,以苦荞幼根根尖为材料 ,提取总RNA并反转录mRNA为cDNA第一链 .通过RT PCR、3′RACE、基因克隆及序列测定 ,获得一种苦荞主要过敏蛋白基因的cDNA片段 (GenBank登录号为AY0 4 4918) .该cDNA片段由 76 8bp组成 ,包括 3′端非编码区 180个bp ,开放阅读框 5 88bp .可编码一个由 195个氨基酸残基组成的功能蛋白及一个终止密码 .苦荞主要过敏原基因与甜荞 2 2kD过敏蛋白、豆球类蛋白的核苷酸序列分别有 95 %和 93%的同源性 .其推导的氨基酸序列与甜荞球蛋白、刀豆蛋白、甜橙柠檬素分别有 93%、83%和 5 7%的同源性 .该过敏蛋白 183～ 188位氨基酸残基KEEEKE在多数不同过敏原中均存在 。

香蕉不同生育期根际微生物生物量及土壤酶活的变化研究

土壤生物学特性对土壤肥力和土壤养分循环非常重要,是土壤肥力的重要生物学指标。然而,在香蕉(Musa spp.)土壤上开展的相关研究还很少。文章探讨了香蕉不同生育期根际土壤微生物生物量、脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶活性的变化规律,以期揭示香蕉土壤养分变化特性,为有效管理土壤养分提供理论依据。在香蕉壮苗期、孕蕾期和生长后期采集根际土样,测定根际土壤生物量和土壤酶活,分析其动态变化及相关性。结果表明,随着生育期的延长,微生物生物量碳(MBC)、微生物生物量氮(MBN)值和土壤脲酶活性从种植到孕蕾期呈现升高趋势,最高值分别为271.64 mg·kg^(–1)、63.09 mg·kg^(–1)和2.38 mg·g^(–1)·24 h^(–1)。从孕蕾期到生长后期又降低。在孕蕾期,MBC值显著高于其他生育期(P<0.05),然而MBN值和脲酶活性与壮苗期和生长后期均无显著差异。蔗糖酶活性从种植到生长后期一直上升,与对照变化趋势一致。酸性磷酸酶活性从种植到孕蕾期一直降低,最低值出现在孕蕾期,为0.54 mg·g^(−1)·24 h^(−1),然后又升高;对照处理则呈持续降低趋势。相关性分析表明,MBC和MBN分别与土壤脲酶和蔗糖酶呈显著正相关。MBN与酸性磷酸酶呈显著负相关。结果表明,孕蕾期为根际土壤生物学特性出现显著变化的重要时期。在香蕉生长后期,根际土壤中微生物生物量、脲酶和酸性磷酸酶的变化预示和微生物生物量相关的土壤有效养分,以及土壤氮素和磷素转化能力的降低。

海马齿SpSCL1基因启动子克隆及序列分析

GRAS蛋白是植物特有的一类蛋白家族,在植物的生长发育方面具有重要作用。根据前期分离的海马齿SpSCL1基因的5'端序列,设计特异引物进行Genome Walking,从海马齿基因组DNA中克隆了SpSCL1基因上游的1 254 bp片段。序列分析表明,该序列包含681 bp的启动子调控序列及573 bp的基因编码序列,启动子调控序中除含有典型的真核生物核心启动子区域(-60^-10bp)外,还含有多个TATA-box、CAAT-box等启动子元件以及多种与脱水、耐盐和光响应相关的顺式作用元件。结果预示海马齿SpSCL1可能在抗旱、耐盐以及光敏色素信号转导途径中发挥重要作用。

皇帝蕉薄片外植体愈伤组织的诱导及植株再生

将皇帝蕉试管苗茎段徒手切成厚约1mm的薄片,经无菌的0.5%柠檬酸溶液处理片刻后,接入各种培养基中。结果表明:(1)适度的暗培养预处理有利于愈伤组织诱导,合适暗培养天数为4d;(2)诱导愈伤组织最佳培养基为:B5+2,4-D13.572μmol/L+IBA4.921μmol/L+NAA5.371μmol/L+KT13.94μmol/L+椰乳5%+PP3330.0001mg/L,愈伤组织诱导率为86.0%;(3)最佳愈伤组织分化芽培养基为:改良MS培养基+BA13.6831μmol/L+NAA0.537μmol/L,芽分化率达到87.0%;(4)诱导芽生根的最佳培养基是:1/2MS+IBA0.492μmol/L(或+NAA0.537μmol/L),生根率达到100%。

巴西橡胶树两个蔗糖合成酶基因的克隆和表达分析

为了解蔗糖合成酶在巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)生长和发育过程中的功能,利用RACE技术从巴西橡胶树中克隆了蔗糖合成酶基因,并对基因的表达特征进行了分析。结果表明,从巴西橡胶树中克隆了两个蔗糖合成酶基因(HbSS1和HbSS2),HbSS1全长2864 bp,编码806个氨基酸;HbSS2全长2815 bp,编码811个氨基酸。两个基因编码的蛋白具有典型的植物蔗糖合成酶结构特征,包含1个磷酸化位点和两个保守的功能域。半定量RT-PCR分析表明,HbSS1和HbSS2在各组织器官中均有表达,其中HbSS1在叶中的表达量最高,HbSS2在树皮中的表达量最高,这说明HbSS1和HbSS2可能参与了各组织的生长和代谢过程,且功能有所分化。

巴西橡胶树泛素结合酶基因HbUBC5的克隆和表达分析

根据先前获得的EST序列,从橡胶树中克隆了1个编码泛素结合酶的基因HbUBC5。HbUBC5 cDNA长度为567 bp,编码185个氨基酸;HbUBC5在基因组中序列长度为2 441 bp,包含6个外显子和5个内含子。HbUBC5编码蛋白具有典型的植物泛素结合酶E2的结构特征,包含1个保守的UBC结构域和1个高度保守的半胱氨酸活性位点,和其他植物中的E2蛋白具有很高的同源性。对HbUBC5启动子区域进行分析,发现含有众多应答激素和胁迫信号元件。实时荧光定量分析结果表明,HbUBC5在树皮的表达量最高,在花中的表达量次之,在胶乳和叶片中的表达量相对较低;乙烯诱导能显著上调基因的表达。研究结果表明,HbUBC5能对乙烯做出响应,推测其可能参与了乙烯利刺激橡胶树产生副作用的过程。

橡胶树3个可溶性无机焦磷酸酶基因的原核表达

焦磷酸酶对橡胶的生物合成具有重要的调控作用。将已克隆的3个可溶性无机焦磷酸酶基因的编码区插入到原核表达载体pGEX-6P-1上,构建3个焦磷酸酶基因表达载体(pGEX-HbSIP1、pGEX-HbSIP2和pGEX-HbSIP3),再将表达载体转入大肠杆菌表达菌株进行诱导表达。结果表明:pGEX-HbSIP1、pGEX-HbSIP2表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,pGEX-HbSIP3只在补充稀有密码子的大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达,表达率分别为35.4%、43.7%和18.5%。对原核表达的蛋白质进行纯化,获得3种可溶性重组蛋白GST-HbSIP1、GST-HbSIP2和GST-HbSIP3,总回收率分别约为7%、8%、3%。该结果为进一步研究这3种焦磷酸酶蛋白的分子特性、抗体制备及功能研究奠定基础。

巴西橡胶树HbHEV3基因的克隆和表达分析

根据EST序列信息,通过RT-PCR获得了一个编码橡胶素前体的基因,命名为HbHEV3。HbHEV3编码区cDNA长度为630bp,编码209个氨基酸。预测的HbHEV3蛋白包含1个信号肽,1个具有几丁质结合特性的Hevein结构域和1个Barwinn结构域,HbHEV3与橡胶树及其他植物中类似蛋白具有很高的同源性。分离获得了HbHEV3起始密码子上游1 050bp的启动子序列,该序列含有众多应答激素和胁迫信号元件。实时荧光定量PCR分析结果表明,HbHEV3在所检测的组织中均有表达,其中在胶乳中的表达量最高,乙烯诱导能显著上调胶乳中HbHEV3的表达。研究表明,HbHEV3可能参与了橡胶树乙烯介导的防御反应,并在橡胶凝集过程中具有重要功能。

巴西橡胶HbERF3启动子的克隆与分析

根据巴西橡胶HbERF3基因序列,利用GenomeWalking技术对其启动子进行克隆和分析,得到了长度为1 572 bp的HbERF3基因的5’端上游启动子区,且分析结果表明,该序列具有典型的真核生物核心启动子区和转录起始位点,除了含有多个TATA-box、CAAT-box等基本顺式元件外,该序列还包含多种与激素应答、逆境胁迫相关的元件。对HbERF3启动子区的克隆和序列分析,为进一步研究HbERF3的表达调控和功能奠定了基础。

海马齿胚胎发育晚期丰富蛋白基因SpLea5的克隆与表达分析

根据筛选文库时获得的EST序列信息,利用RACE技术从海马齿根中分离获得了一个海马齿胚胎发育晚期丰富蛋白基因的全长cDNA,命名为SpLea5。序列分析结果表明,SpLea5基因cDNA全长685 bp,含有一个294 bp的完整开放阅读框,编码97个氨基酸残基;推测编码的氨基酸序列与柽柳、杨木樨、烟草、甜橙、温州蜜柑、麻风树和陆地棉中相应基因的氨基酸序列一致性为54%、52%、48%、47%、47%、46%、44%、41%,在聚类分析时与高等植物聚为一类。SpLea5在海马齿植株中呈组成型表达,但根中表达最为丰富,茎和叶次之;海水、NaCl、PEG、ABA处理均能够诱导根部SpLea5基因的表达。这些结果表明,SpLea5基因可能参与了海马齿对盐和干旱胁迫的分子响应。

不同浓度盐和H_2O_2对海马齿PHGPx活性的影响

磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)是目前发现的唯一能够直接还原膜上脂类过氧化物的抗氧化酶,在保护生物膜免受过氧化损伤方面发挥重要作用。本研究探讨了海马齿PHGPx活性的测定,检测了不同浓度盐和 H2O2胁迫对PHGPx活性的影响。结果显示,以蒸馏水为缓冲液提取的叶片总蛋白效果较好; NaCl梯度浓度处理下,海马齿叶片PHGPx活性呈先降低后升高然后再降低的趋势,其中500mmol/L NaCl处理可以诱导最大活性; H2O2梯度浓度处理下,海马齿叶片PHGPx活性呈先升高后降低再升高趋势,0.5mmol/L H2O2处理获得最大活性;海马齿植株经 H2O2清除剂DMTU处理后再用 H2O2处理,PHGPx的活性降低,同时 NaCl的诱导效果并不受到影响。这些研究结果表明,海马齿中PHGPx的活性受到盐和 H2O2的调节,并且它们对PHGPx酶活的调节可能是两个独立的过程。

巴西橡胶树HbERFB4-1基因的克隆和表达分析

根据EST序列信息,利用RACE技术分离了巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)的1个AP2/ERF类基因,命名为HbERFB4-1。该基因cDNA全长732 bp,含有完整的开放阅读框架,编码147个氨基酸,不含内含子。推导的HbERFB4-1氨基酸序列与杨树(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和大豆(Glycine max)中相应蛋白氨基酸序列的一致性分别为78%、71%、62%和55%,具有典型的AP2类蛋白结构特征。聚类分析表明,HbERFB4-1属于ERF家族B4亚族。半定量RT-PCR分析结果表明,该基因在胶乳中的表达量相对较低,但乙烯利刺激后其在胶乳中的表达量迅速增加,推测该基因可能参与了胶乳中乙烯信号的转导。

巴西橡胶树HbSIP1基因启动子的克隆和序列分析

为研究橡胶焦磷酸酶基因的表达特征及其在天然橡胶生物合成中调控机理,根据巴西橡胶树焦磷酸酶基因HbSIP1序列,利用GenomeWalker方法对HbSIP1基因启动子序列进行了分离,对其序列进行了生物信息学分析,并构建了含有该序列的植物表达载体pSIP1-1381Z。结果表明:分离获得了1198bp的HbSIP1基因启动子序列,该序列具有真核生物典型启动子结构特征,并含有众多应答激素和胁迫信号的调控元件。对HbSIP1的启动子区的克隆和分析,为进一步研究HbSIP1的功能和表达调控机制奠定基础。

植物NAC转录因子

植物生命过程依赖众多转录因子去调控基因的表达。NAC类蛋白是近十多年来新发现的一类植物特有的、数量较多的转录因子家族。研究发现,拥有一个介导DNA结合的特有的N末端新转录因子折叠结构域和一个具有高度多样性的C端转录功能区是这类转录因子共同的结构特征。NAC转录因子不仅普遍参与了植物生长发育过程的调控,包括茎顶端分生组织、花器官的发育、侧根的形成、细胞次生壁的形成以及叶片衰老等,还参与了胁迫应答、激素调控以及诱导寄主对病原菌侵染产生抗性等过程。本文综述了植物NAC转录因子的结构特征、生物学功能、作用机理以及表达调控等方面的研究进展,对该领域的研究进行了展望。

与尖孢镰刀菌枯萎病相关的抑病型土壤研究进展

由尖孢镰刀菌引起的枯萎病是制约作物生产的世界性重要土传维管束病害,危害的作物种类多,损失严重,生产中尚无经济有效的防治方法。抑病型土壤是指对土传作物病害有抑制作用的一类土壤,具有有益微生物种群结构稳定、对土传病害防效持久等特点,因此国内外专家进行了许多卓有成效的研究。本文对尖孢镰刀菌枯萎病相关抑病型土壤的形成因素、作用机制等方面的研究进展进行综述,并对今后尖孢镰刀菌枯萎病抑病型土壤研究的重点方向及应用前景进行了分析和展望,以其为下一步深入研究尖孢镰刀菌枯萎病抑病型土壤的微生物种群结构、有益微生物种类构成、抑病型土壤的构建方法及复合微生物菌肥研制提供新的参考。

香蕉枯萎镰刀菌4号生理小种mon1基因敲除转化子的表型分析及致病力测定

根据笔者实验室前期蛋白质组学研究成果,发现尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Foc4)中的mon1基因影响了尖孢镰刀菌的致病性,为了研究mon1基因在Foc4侵染香蕉过程中的具体作用,利用同源重组方法敲除了Foc4的mon1基因,并对获得的敲除突变体开展表型分析和致病性测定。结果表明,与Foc4野生型菌株相比,敲除突变体生长缓慢、菌丝变细,分支减少及产孢量降低,菌株抵抗外源氧胁迫、细胞壁穿透能力、纤维素利用能力减弱,对巴西蕉苗的致病力明显减弱。由此推测mon1基因在Foc4的生长发育、产孢及致病力等方面具有一定的作用。