食管鳞癌Eca109细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路对LSD1的调控作用

目的:探讨食管鳞癌Eca109细胞中PI3K/AKT/m TOR信号通路对LSD1的调控作用。方法:用不同浓度的PI3K/Akt/m TOR信号通路抑制剂LY294002(0.5、1.0、5.0、10.0、20.0和50.0μmol/L)、RAD001(0.05、0.50、5.00、10.00、20.00和50.00μmol/L)分别处理Eca109细胞24、48 h,采用CCK-8实验检测细胞增殖;然后分别用0、10、20μmol/L LY294002或RAD001处理Eca109细胞24 h或20μmol/L LY294002或RAD001处理不同时间(0~72 h),采用Western blot检测PI3K/Akt/m TOR信号通路因子、LSD1及组蛋白H3K4me2表达的变化。结果:LY294002、RAD001处理后,食管鳞癌细胞增殖受抑,且随浓度的增加,抑制作用有增强的趋势(P<0.05);LY294002抑制Eca109细胞中p-p70S6K的表达,上调Raptor、Rictor、p-Akt(Ser473)以及组蛋白H3K4me2的表达;而RAD001抑制了Raptor、Rictor、p-p70S6K表达,增加p-Akt(Ser473)的表达,并且下调LSD1表达,上调组蛋白H3K4me2的表达(P<0.05)。结论:PI3K/AKT/m TOR信号通路对LSD1存在调控作用。

食管鳞癌细胞中LSD1通过与Notch靶基因启动子结合调控Notch通路相关蛋白表达

目的:探讨食管鳞癌细胞中LSD1对Notch信号通路的调控作用及调控机制。方法:Western blot法检测5种食管鳞癌细胞KYSE450、KYSE790、Eca109、EC9706和TE-1中LSD1及Notch通路相关蛋白的表达情况。用LSD1抑制剂TCP处理KYSE450、KYSE790和Eca109细胞或用LSD1 siRNA处理Eca109细胞,Western blot检测处理前后细胞中LSD1、组蛋白H3K4me2和Notch信号通路相关蛋白的表达情况。结果:5种食管鳞癌细胞中均存在LSD1及Notch信号通路相关蛋白的表达,且表达水平不同;TCP处理后,与未处理组相比,KYSE450、KYSE790和Eca109细胞中LSD1的表达水平均降低,组蛋白H3K4me2表达升高,Notch信号通路相关蛋白的表达均降低(P<0.05);LSD1 siRNA同样使Eca109细胞中LSD1与Notch信号通路相关蛋白表达受到抑制(P<0.05)。结论:食管鳞癌细胞中LSD1对Notch信号通路有调节作用,且LSD1可能是通过与Notch靶基因Hes1的启动子区域结合实现的。

沉默RICTOR基因表达提高食管鳞癌细胞对依维莫司的敏感性

目的:探讨沉默雷帕霉素不敏感的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白伴侣(rapamycin insensitive companion of mammalian target of rapamycin,RICTOR)基因表达后食管鳞癌细胞对依维莫司敏感性的变化,及其可能的分子机制。方法:蛋白质印迹法检测食管鳞癌ECa109、EC9706、TE1、KYSE450和KYSE790细胞中RICTOR蛋白的表达情况。采用脂质体转染法将携带有RICTOR-shRNA和Control-shRNA(对照组)的重组质粒分别转入ECa109细胞中,并筛选稳定转染的细胞株(命名为ECa109-RICTORshRNA和ECa109-control-shRNA)。采用CCK-8法检测沉默RICTOR基因表达后依维莫司对ECa109细胞增殖的影响,再用蛋白质印迹法检测磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路中相关因子RICTOR、Akt、磷酸化Akt(phospho-Akt,p-Akt)(Ser473)、核糖体蛋白S6激酶70 kDa肽(ribosome protein subunit 6 kinase of 70 kDa,p70S6K)、p-p70S6K、40 kDa富含脯氨酸的Akt底物(proline-rich Akt substrate of 40 kDa,PRAS40)和p-PRAS40(r246)蛋白的表达水平。最后,用ECa109-RICTOR-shRNA和ECa109-control-shRNA细胞建立裸鼠移植瘤模型,并用依维莫司进行治疗,观察依维莫司对裸鼠体内移植瘤生长的影响。结果:RICTOR蛋白在5株食管鳞癌细胞中均有表达,且在ECa109细胞中表达水平相对较高。与ECa109-control-shRNA细胞相比,ECa109-RICTOR-shRNA细胞的增殖速度明显变慢(P<0.05);依维莫司对ECa109-RICTOR-shRNA和ECa109-control-shRNA细胞的增殖均有明显抑制作用,依维莫司对ECa109-RICTOR-shRNA和ECa109-controlshRNA细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值分别为(17.68±1.25)μmol/L和(36.84±1.57)μmol/L。沉默RICTOR基因表达后,ECa109细胞中p-Akt(Ser473)和p-PRAS40(r246)蛋白的表达水平明显降低(P值均<0.001),而依维莫司使p-p70S6K蛋白的表达水平下调(P<0.001),但促进了p-Akt(Ser473)和p-PRAS40(r246)蛋白表达水平的上调(P值均<0.001);与ECa109-controlshRNA+依维莫司组相比,ECa109-RICTOR-shRNA+依维莫司组细胞中p-Akt(Ser473)和p-PRAS40(r246)蛋白的表达水平明显降低(P值均<0.001),p-p70S6K蛋白的表达水平无明显变化(P>0.05),提示RICTOR-shRNA能够抑制依维莫司引起的Akt和PRAS40蛋白的磷酸化激活。RICTOR-shRNA和依维莫司均能抑制裸鼠体内ECa109细胞移植瘤的生长(P值均<0.05),并以RICTOR-shRNA联合依维莫司对肿瘤生长的抑制作用最强(P<0.001)。结论:沉默RICTOR基因表达能够提高ECa109细胞对依维莫司的敏感性,其分子机制可能与下调RICTOR表达抑制了依维莫司引起的Akt和PRAS40的磷酸化有关。