牛中华泰勒虫新种(梨形虫亚目:泰勒虫科) 2.分子分类学研究

分离自我国甘肃中部地区土种黄牛的一种形态特异的泰勒虫,采用传统分类学研究鉴定为新种,被定名为中华泰勒虫（Theileria sinensis sp.nov.）。又利用对泰勒虫属特异的PCR引物（92/93）对该种基因组DNA扩增,结果表明该种属泰勒虫属原虫确定无疑,并对代表虫种进化和分类的18SrRNA基因序列进行了测定,对已测出该基因1067bp长片断序列与基因库中9种巴贝斯虫,7种已知牛泰勒虫的相应序列进行比较、分析,建立起系统发生树。树图表明,瑟氏泰勒虫和水牛泰勒虫的亲缘关系非常近,中华泰勒虫与这两个种的亲缘关系较近,与附膜泰勒虫、小泰勒虫、环形泰勒虫、斑羚泰勒虫、突变泰勒虫差异较大。

牛中华泰勒虫(Theileria sinensis sp.nov.)新种 1.传统分类学研究

对分离自我国甘肃中部地区土种黄牛体的泰勒虫未定种作了鉴定。与环形泰勒虫 (T .annulata)、瑟氏泰勒虫 (T .sergenti)、小泰勒虫 (T .parva)、突变泰勒虫 (T .mutans)、斑羚泰勒虫 (T .tautotragi)、附膜泰勒虫 (T .velifera)、水牛泰勒虫 (T .buffeli)作了形态学上的比较研究 ,观察到该未定种除了泰勒虫所共有形态外 ,还有其它泰勒虫所没有的且难以描述的特异形态 ,尤其在染虫率高峰期 ,特异形态占虫体总数的 2 0 %左右。该种还具有出芽增殖的特性 ,可在除脾牛体内大量繁殖 ,染虫率可达 5 2 6 9%的高峰 ,试验感染牛出现高烧、极度贫血、精神沉郁、食欲不振等临床症状 ,导致个别牛只死亡 ,剖检观察到某些脏器有严重病变 ,表明具有一定的致病力。媒介蜱尚不清楚 ,但已证实 ,在我国传播家畜泰勒虫和巴贝斯虫的 7种媒介蜱对该种无传播能力。传统分类学研究结果表明 ,该种不同于已知牛泰勒虫有效种 ,系一新种。由于这一新种首次在中国分离到 ,因而被命名为中华泰勒虫 (Theile riasinensissp .nov .) (梨形虫亚目 :泰勒虫科 )。

在我国新发现的一种牛的泰勒虫（Theileria）未定种

对分离自我国西北某地自然感染牛体的一株泰勒虫（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）未定种，进行了接种试验、形态学观察和部分传播试验。结果表明，该种可在除脾牛体内大量繁殖，寄生物血症达５２．６９％。虫体形态具多形性：有梨子形、圆环形、椭圆形、杆状、三叶形、边虫样、十字架形，还有许多难以形容的不规则形虫体；在同一红细胞内不同数目的边虫样虫体可发育变大，生成的原生质伸延，而后互相连接或交融，重新构成各种不同形态的虫体；有些虫体具有出芽生殖的特性。虫体形态以梨子形和圆环形为主，占所见虫体总数的５１．５％。不能通过长角血蜱和残缘璃眼蜱传播，其病原性、媒介蜱、传播方式、宿主特异性、发育史等尚不清楚。

牛血孢子虫单一种的分离技术及其保藏方法的研究——卵形巴贝斯虫在我国的发现及分离

本文报道从我国河南省卢氏县混合感染有瑟氏泰勒虫的犊牛体,利用虫种间潜伏期的差异性,分离到一种形态较大的巴贝斯虫。将清洁长角血蜱成虫释放到感染该种的牛体上,雌虫饱血产卵后,用次代幼虫和若虫叮咬健康牛。结果证实,该种可由长角血蜱经卵传递,次代幼虫和若虫均能传播病原,潜伏期皆为8天。虫体形态呈卵形、圆形、出芽形、阿米巴形、单梨子形及双梨子形等,内含1—2个染色质团,核外逸现象较常见,中央往往形成空泡。虫体大小为2.3—3.9×1.1—2.1μm,平均为3.57—1.71μm。根据媒介(?),虫体形态和大小、病原性及感染动物的临床症状和病理变化,该种被鉴定为卵形巴贝斯虫(Babesia ovata Minami and Ishihara,1980)。

牛血孢子虫单一种的分离技术及其保藏方法的研究——卵形巴贝斯虫的传播试验

将实验室培育的“洁净”长角血蜱的幼虫、若虫、成虫及微小牛蜱的幼虫,先后分别释放到人工感染卵形巴贝斯虫单一种牛体上不同部位事先粘贴好的布袋中,使其自行叮咬吸血。待饱血脱落后亦分别收集,置28℃、相对湿度约90％的条件下蜕皮或产卵孵化。而后用不同世代和各变态期的蜱,分别叮咬感染除脾和非除脾健康易感牛。结果表明,长角血蜱的当代若虫和成虫对卵形巴贝斯虫没有传播能力,幼虫和若虫吸入的病原亦不能经卵传递;饱血雌虫吸入的病原可经卵传递,次代幼虫、若虫和成虫三个阶段都具有传播能力。次代感染幼虫经兔体后的若虫和成虫也具有感染力。 微小牛蜱不能传播该种病原。

实验性卵形巴贝斯虫病的研究

Fujinaga,T.(1981)进行了实验感染卵形巴贝斯虫(Babesia ovata)的除脾牛和非除脾牛的临床症状、血液学、血液化学及尿液变化研究。该作者1982年又观察了摘除脾脏和地塞米松处理对牛实验感染卵形巴贝斯虫的影响。国内实验性卵形巴贝斯虫病的研究尚无报道。本文报告除脾、注射氢化泼尼松和不作任何处理的3组试验牛,实验感染卵形巴贝斯虫后的临床症状、虫体反应、血液学变化以及病理学观察。

牛血孢子虫单一种的分离技术及其保藏方法的研究——牛巴贝斯虫纯种虫株的分离

本试验对感染双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫混合种的牛连续注射1％台盼蓝溶液3天,用其脑匀浆滤液接种健康易感牛,未分离出牛巴贝斯虫单一种。将洁净微小牛蜱幼虫释放到牛体叮咬10天后,用混合种含虫血感染牛,收集饱血雌虫,置28℃、相对湿度约90％的条件下产卵孵化,用次代幼虫分批感染健康易感牛5头,准确地于幼虫释放后5、4、3天,用杀虫剂杀死正在吸血的幼虫终止感染,对试验牛逐日耳尖采血涂片检查,仅3天杀死幼虫的牛只感染有牛巴贝斯虫单一种。试验结果表明,台盼蓝不能杀灭双芽巴贝斯虫;脑涂片中尽管有大量牛巴斯虫,但它不是寄生于该部位的唯一种;叮咬3天的次代幼虫仅传播牛巴贝斯虫。

甘肃张家川牛卵形巴贝斯虫的分离及补充传播试验

利用甘肃张家川牛体所采集的长角血脾饱血雌虫的次代幼虫，叮咬除脾健康易感牛，于第９天的未稍血液涂片中，发现了典型的卵形巴贝斯虫，第１２天染虫率达到３．１２％的高峰，随后下降至带虫水平。这是在甘肃省首次发现并分离出的一株卵形巴贝斯虫。试验证实，长角血脾雄虫也具有传播卵形巴贝斯虫的能力，卵形巴贝斯虫也可以通过长角血脾隔代垂直传播，这两个结果尚属首次报道。在自然感染牛体采集的饱血雌虫血淋巴涂片中也观察到了卵形巴贝斯虫大裂殖子。

牛血孢子虫单一种的分离技术及其保藏方法的研究——微小牛蜱对边缘边虫的传递试验

将洁净微小牛蜱幼虫释放到感染有边缘边虫的牛体上,摘取正在吸血的半饱成虫、饥饿成虫、半饱稚虫,分别人为地转移到3头健康易感牛体上事先用锌明胶贴好的布袋中。使其继续叮咬,试验牛均遭感染,其潜伏期分别为13天、13天、19天。最高染虫率分别达53.1％、12.0％、8.6％,用从感染牛体脱落饱血雌虫的次代幼虫,叮咬4头健康易感牛,检查时间最短的为30天,最长的达180天,在整个检查过程中,4头试验牛的血液涂片,始终均未发现边缘边虫。试验证明,边缘边虫不能通过微小牛蜱经卵传递,只有当代各变态期的蜱,由感染牛体转移到易感牛且继续叮咬时,才能使边缘边虫得以传播。

牛血孢子虫单一种的分离技术及其保藏方法的研究——牛巴贝斯虫和卵形巴贝斯虫在其媒介蜱血淋巴中的裂殖子观察

将洁净微小牛蜱幼虫和长角血蜱饥饿成虫分别饲喂到人工感染牛巴贝斯虫和卵形巴贝斯虫单一种的牛体上,收集脱落饱血雌虫培育,逐日用断腿法制作血淋巴涂片观察。结果微小牛蜱脱落后第4天的血淋巴中,就观察到了牛巴贝斯虫的游离大裂殖子,其形态似压扁的圆锥体,前端大而钝,后端小而尖,有的尖端稍弯曲或弯曲如钩状。虫体中央有1～3个圆形的核,绝大多数为1个。原生质中有数目不等的空泡,大小为9.0～22.0×1.5～6.0μm,平均13.6×3.14μm。另有圆环形、逗点形、蝌蚪形及其它形态的裂殖子,大多周边布有染色质带,中央往往呈现出一个大空泡。在脱落后第4天的个别长角血蜱的血淋巴涂片中,就可查到大裂殖子,直到第20天,存活蜱的涂片中还可检出。蜱全部获得感染,但虫体出现的时间不规律,仅在少数蜱的涂片中可连续观察到。其形态与上述牛巴贝斯虫血淋巴中典型大裂殖子相似。大小为10.0～19.0×1.5～4.5μm,平均13.84×3.72μm。

草原革蜱各发育阶段对驽巴贝斯虫传播能力的研究

将实验室培育好的“清洁”草原革蜱成虫，释放到驽巴贝斯虫单一种人工感染的驴体上，使其自行叮咬吸血，俟雌虫饱血脱落后，置２８℃、相对湿度约９０％的温箱中产卵孵化。而后用次代３个不同发育阶段的蜱，分别叮咬除脾或非除脾健康易感驴。试验结果表明，草原革蜱在成虫阶段被驽巴贝斯虫感染，并经卵传递。次代幼虫、若虫和成虫都具有传播该种病原的能力。另外，还发现在草原革蝉卵内发育的驾巴贝斯虫，对易感宿主动物也具有感染性。

锥虫长期超低温保藏方法的研究

作者观测了不同保护剂、稀释液、pH值、降温方法、复苏温度、冻融次数、液相气相交替以及解冻后在普通冰瓶中存放时间对伊氏锥虫浙江虫株的感染性及致病力的影响。在此试验基础上,又对伊氏锥虫的6个不同虫株、媾疫锥虫、刚果锥虫、布氏锥虫等4个种的9个虫株,进行了超低温保藏试验和长期保藏效果观察。已测定的有效保藏期伊氏锥虫达574～3200天、媾疫锥虫达2866天、刚果锥虫达763天、布氏锥虫达783天。通过反复试验,提出了锥虫的常规保藏方法。

浅谈卵形巴贝斯虫和卵形巴贝斯虫病

Minami等(1980)在发表卵形巴贝斯虫(Babesiaovata Minami and Is-hihara,1980)新种时的文章中回顾到,自1911年Tokishige首次报告日本的牛感染有巴贝斯虫以来,许多学者对分布于日本(除冲绳而外)牛的一种大型的巴贝斯虫未定种进行了长时间的研究,对分类地位进行了讨论。To-kishige和Ogura(1929)把这个种认作为双芽巴贝斯虫(B.bigemina)或与此相关的种,而Iseki(1924)却认为是与牛巴贝斯虫(B.bovis)或分歧巴贝斯虫(B.divargens)相关的种。Ishiha-ra(1968)证实,日本牛的巴贝斯虫是由纽曼氏血蜱(Haemaphysalis neumanni,即H.longi-cornis)通过次代幼虫传播。

尚待命名的牛泰勒虫一新种

原始虫株分离自中国甘肃中部地区自然感染带虫牛体(白启等,1995),经接种健康除脾牛大量繁殖后,活虫种保藏在中国兽医原虫资源库。试验用动物均为1～2岁健康除脾黄牛。供试蜱有残缘璃眼蜱(Hyalomma detritum)、长角血蜱(Heamaphysalis longicornis)、青海血蜱(H.qinghaiensis)、森林革蜱(Der-macentor silvarum)、微小牛蜱(Boophilus microplus),均系本实验室培育繁殖的清洁蜱。

牛的巴贝斯虫18S rRNA基因序列比较研究

对中国已报道的8株牛的巴贝斯虫(包括1株牛巴贝斯虫、1株双芽巴贝斯虫、1株大巴贝斯虫、3株卵形巴贝斯虫和2株巴贝斯虫未定种)的18S rRNA基因序列进行了测定与比较.自感染动物的血液中纯化虫体,提取基因组DNA,PCR扩增靶基因,然后将其连接到pGEM-T Easy载体上,进行克隆测序.研究结果显示:牛的巴贝斯虫18S rRNA基因大小在1 653～1 699 bp之间;用所测得的和自GenBank下载的各种动物的巴贝斯虫18SrRNA基因序列构建了系统发生树,发现由刻点血蜱传播的大巴贝斯虫伊犁株与由长角血蜱传播的3株卵形巴贝斯虫存在明显差别,应属于2个独立种;由小亚璃眼蜱传播的牛巴贝斯虫未定种不同于目前已报道的任何种类,在中国应为一个新种.因而,中国存在5种牛的巴贝斯虫,即:牛巴贝斯虫,双芽巴贝斯虫、大巴贝斯虫,卵形巴贝斯虫和巴贝斯虫未定种.

我国牛羊梨形虫病病原的收集与鉴定

目的建立标准化的梨形虫病病原收集与鉴定技术,用于我国牛羊梨形虫病的防治研究。方法自野外采集动物血液或媒介蜱,根据形态进行蜱种鉴定,实验性感染除脾动物,对我国不同地区、不同家畜的梨形虫病病原进行分离,并通过蜱传播试验确定媒介蜱的种类与传播方式;采用18S rRNA基因测序方法,对本实验室已分离的部分梨形虫进行进化关系研究。结果获得34个牛和羊的梨形虫不同地区分离株,并对病原进行了分类鉴定。结论采用血液注射或蜱传播试验可对梨形虫进行有效分离,通过传统分类学和病原进化关系研究,可对动物梨形虫进行正确的分类鉴定。

四川省汶川县两种牛梨形虫的分离鉴定

自四川省汶川县黄牛体表采集长角血蜱的饥饿或半饱血成虫,带回实验室感染除脾牛。血液涂片检查发现,感染后第10 d,病牛血液中出现一种大型巴贝虫,感染后第24 d,出现一种小杆形的泰勒虫。形态学观察和18 S rRNA基因测序和进化关系分析证明,它们分别为卵形巴贝虫与瑟氏泰勒虫。

吕氏泰勒虫cDNA表达文库的构建及其抗原基因的免疫筛选

【目的】构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库,并从中筛选抗原候选基因。【方法】从吕氏泰勒虫裂殖子直接提取和纯化mRNA,采用oligo(dT)引物合成双链cDNA,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将所产生的cDNA分子定向克隆到具有EcoRⅠ/HindⅢ粘性末端的λSCREEN载体的两臂之间。用PhageMaker extract对连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,并用之转染大肠杆菌ER1647,从而构建成吕氏泰勒虫的cDNA表达文库。用吕氏泰勒虫阳性血清和兔抗绵羊IgG-AP筛选得到阳性克隆,经测序和Blast软件分析并获得新基因。【结果】成功构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库,其初级库容量约为1.0×106PFU,扩增文库的滴度为8.2×108PFU·ml-1,文库重组率为100%;通过免疫学筛选、测序和Blast软件分析,共获得30个新基因,其中15个基因已登录GenBank/NCBI。【结论】为研究泰勒虫疫苗、新型医药和诊断抗原,以及发展可持续性防制羊泰勒虫病提供基本材料。

在中国新发现的一种羊的巴贝斯虫(Babesia)未定种

在中国甘肃某地自然感染发病绵羊的血液涂片中，观察到一种大型的巴贝斯虫（Ｂａｂｅｓｉａ）。虫体形态具多形性，有双梨籽形、单梨籽形、圆环形、棒状、不规则形、逗点形和三叶形。典型双梨籽形虫体的大小为１．８～２．５μｍ×０．９～１．８μｍ，平均（２．２１±０．１２）μｍ×（１．１７±０．１８）μｍ。个别红细胞中寄生有４个或８个虫体。该虫种特征性的形态是三叶形。它是相连的双梨籽形虫体两尖端的核质延伸（出芽），并生出原生质，发育成一个完整的梨籽形虫体，与母体共同排列形成三叶形的。该虫种可引起绵羊严重发病和死亡。本研究对自然感染发病羊的临床症状和死亡羊的病理变化进行了观察。该虫种的形态大小和致病力，与莫氏巴贝斯虫（Ｂ．ｍｏｔａｓｉ）和粗糙巴贝斯虫（Ｂ．ｃｒａｓｓａ）明显不同。

长角血蜱的免疫研究进展

以长角血蜱疫苗候选抗原为例,从长角血蜱蛋白水解酶、蜱生殖和发育相关分子及RNA干扰技术、IgG结合蛋白技术几方面概述了近年来国内外有关蜱疫苗的研究现状,并展望了蜱疫苗的发展趋势。