苏云金芽胞杆菌杀线虫伴胞晶体蛋白基因cry6Aa的克隆与表达

通过对晶体蛋白N-末端氨基酸测序,设计简并探针,从对根结线虫高毒力苏云金芽胞杆菌YBT-1518菌株中克隆到1个含有杀线虫晶体蛋白基因的片段。序列测定表明该序列含有两个ORF(orf1和orf2),其中orf1与基因cry6Aa1同源性为98%,已在GenBank上登录(Acc.NO.AF499736),并被命名为cry6Aa2。将克隆的该片段克隆到穿梭载体pHT304上,并转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171,重组菌株可形成米粒状伴胞晶体。生物测定表明,表达的毒素蛋白对北方根结线虫的LC50为9.47μg/mL,毒力与出发菌株(10.74μg/mL)相当。

牛结核病荧光定量PCR快速检测方法的建立及初步应用

目的建立牛结核病荧光定量PCR快速检测方法。方法根据分枝杆菌的插入序列IS1081设计引物和探针,优化反应条件,建立标准曲线,进行特异性、敏感性、重复性实验,并用所建立的方法对临床样品进行检测。结果该方法的敏感性达到了10个拷贝,且特异性高,重复性好。对30份PPD试验和巢式PCR检测都为阳性的临床样本进行荧光定量PCR检测的结果全部为阳性;而对PPD检测阳性,巢式PCR检测为阴性的15份临床样本进行检测时,2份为阳性;在对2份PPD检测阴性而巢式PCR检测阳性的临床样本的检测结果也为阳性。结论成功建立了牛结核病荧光定量PCR快速检测方法,对临床样品的快速检测和牛结核病的早期诊断具有重要意义。

2011年广州从化地区诺如病毒感染的分子流行病学研究

目的探讨广州从化地区诺如病毒分子流行病学特点,分析从化地区诺如病毒的基因型。方法收集2011年1—12月从化地区腹泻患者标本218份,采用荧光RT-PCR对临床标本进行检测,同时针对诺如病毒ORF2基因区段设计引物,随机选取5株病毒进行ORF2基因序列测定。用ClustalW和MEGA5.0等软件进行序列特性分析和基因型分析。结果 218份临床标本中检测到38份阳性标本,检出率为17.43%。阳性率较高的月份为9、10、11、12月,全年最低检出率的时间为6、7月份(均为0),最高检出率的时间为11月份(32%)。扩增了5株诺如病毒ORF2基因序列,序列分析发现与GenBank中GⅡ组诺如病毒的相似性为76%～98%,与GⅠ组为43%～55%,其中与GⅡ-4组Farmington Hills、Lorsdale、ShanghaiSH52009等株同源性为94%～98%,确认该5株诺如病毒属于GⅡ-4型。进一步的氨基酸序列分析发现与f亚型2006b新变株同源性为97%。结论广州从化地区诺如病毒主要流行季节是冬季,克隆的5株诺如病毒属于GⅡ-4f 2006b型。2011年从化地区以GⅡ-4f2006b新变异株为主要流行株。

荧光RT-PCR与RT-LAMP检测GⅡ4型诺如病毒的比较和应用

目的建立在临床或疾控上可进行简单、快速、灵敏、有效的GⅡ4型诺如病毒的检测方法。方法根据GⅡ4型诺如病毒基因组保守序列建立实时荧光RT-PCR和RT-LAMP检测方法,研究两者的敏感性、特异性和灵敏度,并进行临床应用。结果建立了GⅡ4型诺如病毒的实时荧光RT-PCR和RT-LAMP检测方法,敏感性和特异性良好,灵敏度相当。结论实时荧光RT-PCR和RT-LAMP可在临床或疾控应用。

儿童呼吸道腺病毒3型爆发流行的病原学研究

目的探讨广州市某幼儿园爆发流行的急性咽结膜热的病毒病原学.方法采集急性咽结膜炎患儿急性期的眼、咽拭子进行PCR及序列分析.结果32份咽拭子中20份PCR阳性,阳性率62.5%,用分型引物检测及序列分析,均证实为单一腺病毒3型感染.结论本次急性咽结膜炎是由腺病毒3型引起.

SARS冠状病毒M蛋白的原核表达及其DNA疫苗构建

为探讨SARS CoV的M蛋白的免疫学特性以及M蛋白作为SARS CoV病毒疫苗组分的可行性和必要性。分别用pET 15b和pET 22b在大肠杆菌中表达SARS CoV的M蛋白,亲和层析纯化后作为抗原应用。同时,将M蛋白的编码基因克隆进分泌型真核表达载体pSecTagB中得到重组质粒pSecM作为DNA疫苗,免疫BALB/c小白鼠、制备SARS CoV M蛋白的抗血清。并用纯化后的M蛋白建立的SARS CoV M抗体ELISA检测技术研究所构建的M DNA疫苗的免疫效果。结果表明:两种重组M蛋白在大肠杆菌中均以可溶性形式得到高效表达,经与华大产的用灭活SARS全病毒制备的SARS CoV抗体ELISA检测试剂盒比较实验,证明该原核表达的重组M蛋白能与SARS确诊病人血清以及M DNA免疫鼠血清发生特异性抗原抗体反应。这两种重组M蛋白有可能作为抗原组分用于临床SARS CoV检测中;所构建的SARS CoV的M基因核酸疫苗能在小鼠体内产生特异性抗体,提示M蛋白在SARS CoV疫苗尤其是组分疫苗的研制中应加以考虑,为DNA疫苗的开发提供了依据。

增城与广州地区乙型肝炎病毒基因分型比较研究

目的增城地区与广州地区的乙型肝炎病毒基因型的差异性比较.方法利用荧光PCR法对HBV携带者进行基因分型。结果增城地区B型占87.0%,C型占11.6%,BC混合型占1.4%,没有发现D型;广州地区B型占48.9%,C型占43.7%,BC混合型占6.5%,D型占0.9%。结论增城与广州HBV DNA基因分型存在一定差异。

荧光RT-PCR与RT-LAMP检测GⅡ4型诺如病毒的比较和应用

诺如病毒（ Noroviruses,NVs）是急性病毒性胃肠炎暴发的主要病原之一,是引起儿童和成年人非细菌性胃肠炎的主要病原[1].NVs呈全球性感染,频繁暴发流行,被世界卫生组织（WHO）定为B类病原,近年来我国的相关疫情报告也在增多[2-4].NVs胃肠炎主要通过污染的食物或水引起,海产品是食源性NVs胃肠炎的重要病因,接触或感染者呕吐物的气溶胶是暴发传播的主要途径.

实时荧光定量PCR法筛查唐氏综合征的实验研究

目的建立一种无创性、高特异性的快速筛查唐氏综合征(Down′s syndrom e,DS)的检测方法。方法采用实时荧光定量PCR技术对正常人和DS患者外周血样本的有核细胞进行检测,根据△C t值的差异建立检测方法。结果正常组和唐氏组△C t值有显著性差异(P<0.001),初步建立了实时荧光定量PCR筛查唐氏综合征的快速检测方法。结论实时荧光定量PCR具有无创性、特异性高且简单、快速等优点,适用于唐氏综合征产前筛查。