苦荞转录因子基因FtMYB1的克隆及序列分析

采用RACE-PCR技术,从苦荞花蕾克隆得到一个MYB基因(FtMYB1)。结果表明,FtMYB1基因DNA序列全长863bp(GenBank,JF313344),含两个内含子,内含子1长度为78bp(134～211bp),内含子2长度为74bp(342～415bp);cDNA序列全长711bp(GenBank,JF313345);开放阅读框(ORF)编码236个氨基酸,理论分子量26.9kDa,等电点6.33。序列比对及同源建模分析表明,FtMYB1蛋白与其他植物MYB结合域有高度的同源性,具有MYB同源蛋白的典型特征。

苦荞类异黄酮还原酶基因(FtIRL)的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,从苦荞(Fagopyrum tatarium)中克隆得到类异黄酮还原酶基因(IRL)的开放阅读框序列(ORF),命名为FtIRL。序列分析表明:FtIRL含一个长942bp的ORF,编码313个氨基酸,其氨基酸序列与金荞异黄酮还原酶FcIFR(GenBank登录号ABV02071)同源性最高,达到97%;与其他植物IRL同源性为44%～73%。生物信息学分析表明:FtIRL推导的蛋白质含有典型的底物结合口袋和保守的NADPH结合位点,符合短链脱氢酶家族的结构特征。构建基于氨基酸的系统发育树表明,苦荞FcIFR虽然在氨基酸序列上与其他植物的异黄酮还原酶(IFR)有较高的同源性,但其生物学功能可能更接近落叶松脂醇还原酶(PLR)。

5份金荞麦核糖体基因内转录间隔区(ITS)序列分析

以5份金荞麦为材料,对其核糖体基因内转录间隔区(ITS)序列进行PCR扩增,均获得长约700 bp左右的特异性产物。测序结果表明,金荞麦样品中ITS序列在638～797 bp之间。经软件Clustal X2.0和MEGA 4.0分析结果表明,当空位作为缺失处理时,ITS区全序列包括488个保守位点,248个变异位点,67个简约信息位点,175个单个碱基变化位点。通过与GenBank已登录的金荞麦的ITS进行序列比对后发现,其同源度在86.8%～98.8%,其变异位点主要存在于ITS1,表现出丰富的遗传多样性。采用邻接法构建的系统进化树表明,金荞麦主要分为两大类群,其遗传距离与其采集地有一定相关性。

金荞麦花青素合酶基因的克隆及其表达与花青素量的相关性研究

目的获取金荞麦花青素合成途径关键酶花青素合成酶(anthocyanins synthase,ANS)基因的全长序列,并进行序列分析;对花期金荞麦ANS基因在各组织中表达水平与花青素量的相关性进行分析。方法利用同源克隆技术获得ANS基因cDNA序列;采用半定量RT-PCR对ANS表达量进行分析;采用分光光度法测量花青素量。结果金荞麦ANS基因cDNA包含一个1 077 bp的ORF,编码358个氨基酸,命名为FdANS。生物信息学分析表明,该基因编码蛋白与其他植物ANS蛋白氨基酸序列同源率较高。FdANS在花期金荞麦不同组织中的表达量分析表明,其表达量花>叶>茎>根,花青素量为花>叶>茎>根。结论在金荞麦中首次获得ANS基因的cDNA序列,编码蛋白具有ANS同源蛋白的典型特征。FdANS基因在金荞麦根、茎、叶和花中的表达量与花青素量具有相关性。

金荞麦查尔酮异构酶的基因克隆及其花期表达与黄酮量分析

目的获取金荞麦总黄酮合成途径的关键酶查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)基因的全长序列,并进行序列分析;对花期金荞麦CHI基因在各组织中的表达与总黄酮量进行分析。方法利用同源克隆技术获得金荞麦查尔酮异构酶基因(FdCHI)的cDNA序列;采用半定量RT-PCR对CHI表达量进行分析,并采用AlCl3法测量总黄酮量。结果金荞麦FdCHI基因cDNA包含一个750 bp的ORF,编码249个氨基酸,命名为FdCHI。生物信息学分析表明该编码蛋白与其他植物CHI氨基酸序列同源率较高。FdCHI在花期金荞麦不同组织中的表达量分析表明,其表达量花>根>叶>茎,总黄酮量为花>叶>茎>根。结论在金荞麦中首次获得CHI基因的cDNA序列,编码蛋白具有CHI同源蛋白的典型特征。FdCHI基因在金荞麦茎、叶和花中的表达量与总黄酮量具有相关性,但在根中表达量与总黄酮量相关性较小。

金荞麦黄酮醇合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的克隆金荞麦黄酮醇合酶(FdFLS)基因的编码序列,并对该基因进行序列分析、原核表达及其活性研究。方法采用同源克隆技术获得FdFLS基因cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;构建FdFLS原核表达载体pET-30b(+)-FdFLS,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并测定目标蛋白的酶学活性。结果 FdFLS基因开放阅读框(ORF)全长1 008 bp,编码334个氨基酸;FdFLS基因在大肠杆菌中可表达出相对分子量约4×104的蛋白,并具有将二氢槲皮素和二氢山柰酚转化为槲皮素和山柰酚的催化活性。结论首次克隆到FdFLS基因,并实现该基因在大肠杆菌中有活性的表达。

金荞麦苯丙氨酸解氨酶基因FdPAL的克隆及原核表达

目的:克隆金荞麦苯丙氨酸解氨酶(FdPAL)基因DNA和全长cDNA序列,对该基因进行序列分析,原核表达及其活性相关研究。方法:采用同源克隆和RT-PCR技术扩增苯丙氨酸解氨酶基因的DNA序列和全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析;构建PAL原核表达载体pET30b(+)-FdPAL,在大肠杆菌Escherich coli BL21(DE3)中进行诱导表达,使用分光光度计法定量测定其酶活,使用薄层色谱法鉴定其催化活性。结果:金荞麦PAL基因DNA序列全长2 583 bp,由2个外显子,1个内含子构成(命名为FdPAL,GenBank登录号为HM628904);cDNA序列包含1个2 169 bp的开放阅读框(ORF),编码722个氨基酸,理论相对标准分子质量78.31 kDa,等电点5.94。SDS-PAGE分析表明,诱导后的新生蛋白质相对标准分子质量为75.37 kDa;诱导4 h后,表达产物的苯丙氨酸解氨酶比活力最高,达到4 386 nmol.g-1.min-1;薄层色谱结果表明,诱导表达产物具有催化苯丙氨酸转化为肉桂酸的活性。结论:首次从金荞麦中克隆到PAL基因,该基因具有植物PAL同源基因的典型特征;重组的金荞麦PAL基因表达载体[pET30b(+)-FdPAL]能有效地在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达,并形成具有一定催化功能的酶。