迟缓爱德华氏菌间接ELISA快速检测法

以迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)WY28作为抗原,免疫新西兰兔,获得效价为1:2048的多克隆抗体;以此多克隆抗体作为一抗,山羊抗兔IgG-HRP作为酶标二抗,建立迟缓爱德华氏菌的间接ELISA快速检测法。采用棋盘滴定法确定抗原与一抗的最佳工作浓度分别为106CFU·mL-1和1:10000;酶标二抗的最适工作浓度为1:1000。病原菌检测灵敏度为每孔103CFU。该方法标准化后具有快速、灵敏等特性,与肠杆菌科其他细菌参考菌株无交叉反应,具良好的特异性。对养殖场发病大菱鲆(Scophthalmus maximus)和半滑舌鳎中分离的细菌菌株进行检测,从56株分离菌株中检测出27株迟缓爱德华氏菌,阳性检出率为48.2%。该方法的建立有助于快速准确地诊断由迟缓爱德华氏菌引起的养殖鱼类病害。

猪鼻支原体TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法的建立

为建立快速检测猪鼻支原体(M.hyorhinis)的荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中登录的p37基因序列设计并合成引物及MGB探针,构建含有p37基因的重组质粒,以其为标准品绘制标准曲线,并检测该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示该方法具有良好的特异性,与猪肺炎支原体、猪絮状支原体、猪滑液支原体、鸡毒支原体、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪圆环病毒、猪瘟病毒及猪流感病毒无交叉反应,对M.hyorhinis的检测敏感性为10拷贝/μL,并且稳定性好,变异系数小于2%。利用建立的荧光定量PCR方法对55份临床样品进行检测,阳性检出率为87.3%(48/55),而分离培养方法和普通PCR的阳性检出率分别为41.8%(23/55)和29.1%(16/55)。该结果表明,建立的方法特异性强、敏感性高、稳定性好,可以用于M.hyorhinis临床样品的检测,对M.hyorhinis的快速和定量检测具有重要意义。

哈维氏弧菌密度感应系统对几种胞外酶的活性影响

密度感应系统是细菌通过感受群体密度变化而控制基因特定表达的1种机制。对病原菌密度感应系统的研究有助于找到新的抗感染策略。目前哈维氏弧菌分泌的蛋白酶、脂酶、磷脂酶和溶血素等致病相关因子是否受密度感应系统的控制尚不清楚。哈维氏弧菌有3个平行的密度感应系统。本研究通过检测3个密度感应系统基因突变株的胞外酶(如蛋白酶、脂酶、磷脂酶和溶血素等)活性,发现明胶酶的活性受密度感应系统的信号分子HAI-1和AI-2的正控制,且受AI-2的控制程度更大;脂酶也在一定程度上受HAI-1和AI-2的正控制;卵磷脂酶受HAI-1的负控制;溶血素受HAI-1和AI-2共同的负控制。结果表明,哈维氏弧菌胞外分泌的几种毒力相关因子都受密度感应系统的调控,但控制方式各不相同。

PCR技术检测猪肺炎支原体的研究进展

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是引起猪支原体肺炎的重要病原,该病常引起继发感染和混合感染,严重威胁养猪业发展,造成巨大的经济损失。利用PCR技术对猪支原体肺炎早期正确诊断具有非常重要的意义。从猪肺炎支原体的特异性靶基因、临床样品采集方法与样品DNA处理方法、关键技术因素及普通PCR技术、多重PCR技术、套式PCR技术、荧光定量PCR技术、芯片检测和环介导等温扩增技术等在猪肺炎支原体检测中的研究进展、主要优缺点及应用进行综述。

支原体脂蛋白及其变异与宿主互作研究进展

脂蛋白是支原体的重要结构,在支原体与宿主间的互作中有重要作用,近些年越来越多的报道指出脂蛋白在支原体毒力及致病性中占有重要地位。介绍支原体脂蛋白的特性和功能,黏附作用,致炎性反应和诱导细胞凋亡的作用。进一步阐述脂蛋白在基因家族的调控下通过ON/OFF开关、大小变异、结构重组、基因水平转移及抗原调节等发生抗原相位变异的机制,以及脂蛋白变异在支原体致病力方面的影响和重要生物学意义。

江苏省部分地区动物弓形虫病血清学调查

以间接血凝(IHA)试验方法对江苏省部分地区(徐州、连云港、盐城、宿迁、南通、泰州、扬州、南京、常州、宜兴、昆山)动物弓形虫病进行血清学调查。试验血清样品稀释度在1∶64时,致敏血球达到50%以上凝集的血清样品判为阳性。结果在所调查的1 100份血清样品(猪、牛、羊、猫、狗等动物)中弓形虫抗体呈阳性者为145份,占总调查血清数的13.2%,其中939份猪血清样品中阳性样品数120份,占总调查猪血清样品的12.8%,总体反映出江苏省内动物弓形虫病感染的概况。

集成联合用药、隔离早期断奶(SEW)和“三点式”生产体系培育猪气喘病阴性群

为探索猪肺炎支原体阴性群的培育方法,本试验研究了集成联合用药、SEW和"三点式"饲养管理体系等技术对猪肺炎支原体的净化效果。先通过妊娠母猪的筛选,母猪程序性用药,SEW技术,屏障隔离系统,"三点式"生产饲养管理体系及仔猪程序性用药的培育方法,再通过猪肺炎支原体血清抗体检测和荧光定量PCR检测鼻拭子的方法对所培育的仔猪进行长达4个月的监测,结果发现新培育的5批猪在35日龄后血清抗体均为阴性,鼻拭子抗原检测全为阴性。结果表明集成联合用药、SEW和"三点式"生产管理体系技术可以有效净化猪肺炎支原体,为国内猪气喘病的控制和净化提供理论基础及临床实践经验。

几种佐剂对猪支原体肺炎灭活疫苗的免疫增强作用比较

为研发和评价猪支原体肺炎(MPS)灭活疫苗新型佐剂,本研究以水包油乳剂或水性高分子聚合物卡波姆佐剂为基础的MPS灭活疫苗,在其中分别添加左旋咪唑、黄芪多糖、免疫刺激复合物基质(ISCOM-matirx)或胸腺肽,得到不同的佐剂配方,同时选用3种商品化佐剂进行同步试验评价。将这些佐剂与MPS灭活疫苗合用免疫小鼠,检测淋巴细胞增殖情况及血清抗体IgG水平,用以比较几种佐剂对该疫苗中的免疫增强效果。结果表明,与对照组相比,各佐剂组均有明显免疫应答反应。其中,卡波姆+ISCOM-matrix佐剂组对增强小鼠淋巴细胞增殖能力及血清中抗体水平为各组间最高,其次为卡波姆+左旋咪唑佐剂组;GEL 01 ST佐剂能够增强疫苗的细胞免疫刺激能力,而对体液免疫作用稍差,卡波姆+胸腺肽佐剂组的血清抗体水平较高,但对淋巴细胞增殖没有明显作用。本实验结果将为后续的MPS灭活疫苗的研发提供了实验依据。

猪肺炎支原体显色原位杂交研究方法的建立

为建立猪肺炎支原体(Mhp)显色原位杂交(CISH)定位检测方法,本研究利用地高辛标记的Mhp P36核酸探针和DAB/H2O2显色系统,对人工Mhp感染组、自然感染组和健康对照组的实验猪肺组织样品和临床样品进行显色原位杂交检测。结果显示,设计的地高辛标记探针针对Mhp具有特异性,而与其他的猪病原菌无交叉反应;检测结果可以通过显微镜观测到Mhp定位在支气管/细支气管黏膜表面。人工感染组、自然感染组和健康对照组的CISH结果与PCR检测结果一致,临床样品的CISH检测结果低于PCR检测结果。本研究建立的Mhp显色原位杂交法是一种集直观和敏感为一体的检测方法,可以用于Mhp的定位检测和致病机理研究。

猪肺炎支原体的分离方法

为了寻求分离猪肺炎支原体更好的方法,本试验采用剪碎法、研磨法、匀浆法和灌洗法对猪肺组织进行处理,并研究了不同肺脏组织处理方法对猪肺炎支原体活力的影响。结果显示,剪碎法与灌洗法获得的处理液对猪肺炎支原体的影响小于研磨法与匀浆法。采用剪碎法、灌洗法和研磨法对100份猪肺组织进行猪肺炎支原体野毒株分离的结果显示,经PCR鉴定,剪碎法分离到1株猪肺炎支原体,分离率为1%;研磨法分离到7株猪肺炎支原体,分离率为7%;灌洗法分离到2株猪肺炎支原体,分离率为2%。以上结果表明,研磨法获得的组织处理液对支原体活力有一定的影响,但其分离率好于剪碎法和灌洗法。因此,研磨法是一种较好的猪肺炎支原体分离方法。

猪鼻支原体3种核酸检测方法的临床应用比较

为研究猪鼻支原体(Mhr)核酸检测方法的优越性及在临床应用中的价值,本实验比较了常规PCR、套式PCR和荧光定量PCR 3种方法的敏感性,并进行了临床样品的检测。常规PCR敏感性为104拷贝/μL,套式PCR和荧光定量PCR敏感性均为10拷贝/μL;对74份肺组织、36份气溶胶、99份鼻拭子和47份气管支气管灌洗液样品进行检测,常规PCR、套式PCR、荧光定量PCR检出率分别为18.0%(46/256)、53.9%(138/256)和55.1%(141/256)。常规PCR与套式PCR、荧光定量PCR方法的检出率差异极显著(p<0.01),而套式PCR与荧光定量PCR方法的检出率差异无显著性(p>0.05)。结果表明,套式PCR敏感性高,具有较高的临床实用价值;荧光定量PCR敏感性高,最具有实验室诊断价值,但对操作者要求较高;常规PCR方法敏感性稍低,可能造成漏检,但易于操作,对条件简单的基层实验室仍有一定的实用性。在检测临床样品时,推荐采用套式PCR结合荧光定量PCR,结果更为准确可靠,可以提高Mhr的检出率。

猪肺炎支原体气溶胶富集检测技术的初步研究

为了建立一个简单易行的猪肺炎支原体气溶胶富集和检测技术,结合液体冲击式采样器和过滤式采样器的原理,自行设计一个气溶胶双重富集装置,并在密闭环境下采集人工制备的猪肺炎支原体气溶胶,荧光定量PCR检测以确定该装置的采集效率。再通过收集不同猪群中的气溶胶进行检测以确定该装置临床应用的可行性。首先,收集人工感染Mhp阴性仔猪后不同时间猪舍内的气溶胶;其次,收集1个猪支原体肺炎发病猪场和1个阳性未发病猪场的产房、保育舍和育肥舍共11个猪舍的气溶胶,荧光定量PCR或套式PCR检测所收集的气溶胶。结果显示:实验室模拟采样的采集效率达到(37.04±6.43)%,人工感染猪肺炎支原体后7天即在饲养房间的气溶胶中检到猪肺炎支原体;2个猪场共11个不同猪舍气溶胶中猪肺炎支原体检测结果均为阳性,检出率100%。成功建立了一个简单易行的猪场猪肺炎支原体气溶胶富集及检测技术。

猪肺炎支原体对上皮细胞氧化损伤的分析

分析猪肺炎支原体致病株168和弱毒株168L对上皮细胞的氧化损伤。用猪肺炎支原体168和168L株体外感染猪肺泡上皮细胞(SJPL),通过对感染细胞进行MTT和NO检测,筛选感染时间和感染剂量,利用间接免疫荧光(IFA)检测细胞上Mhp,通过H2O2和DAPI验证细胞损伤。结果:在5×106 CCU感染36h时,细胞活力相同,Mhp168株感染细胞的NO浓度显著高于Mhp168L株(P<0.05);H2O2检测显示Mhp168对细胞的氧化损伤显著高于Mhp168L株,同时都显著高于对照(P<0.01);IFA观察分析显示Mhp168株在细胞上的黏附量高于Mhp168L。DAPI染色显示Mhp168对细胞造成的损伤程度高于Mhp168L。通过优化感染时间和感染剂量,找到了猪肺炎支原体强弱毒株对上皮细胞损伤的显著差异点,分析了猪肺炎支原体强弱毒株对上皮细胞的氧化损伤,为深入研究猪肺炎支原体强弱毒株感染细胞的差异机制奠定了基础。

不同毒力的猪肺炎支原体对宿主细胞的黏附

为研究不同毒力的猪肺炎支原体对宿主细胞的黏附作用,本研究采用体外培养的猪气管环检测不同毒力的猪肺炎支原体代表菌株对猪气管上皮细胞及纤毛的损伤情况,初步验证不同猪肺炎支原体代表菌株的毒力。应用间接免疫荧光技术研究不同猪肺炎支原体分离株、标准株、168致弱株及疫苗株对猪肾细胞PK15、肺泡上皮细胞SJPL和猪肺泡巨嗜细胞3D4/31的黏附情况。结果表明猪肺炎支原体野毒株XLW-1能引起猪气管上皮细胞严重病变及纤毛损伤、脱落;国际标准弱毒株J株仅能引起猪气管上皮细胞轻微病变;168疫苗株既不能引起猪气管上皮细胞病变,也不能引起纤毛损伤。野毒株XLW-1、国际标准强毒株232株、弱毒株J株及168疫苗株均能黏附PK15、SJPL和3D4/31,168致弱株可以黏附PK15和SJPL。野毒株、标准强毒株、标准弱毒株、168致弱株及疫苗株均能黏附PK15、SJPL和3D4/31。

猪肺炎支原体P216基因片段的表达及黏附活性研究

本研究旨在研究猪肺炎支原体P216蛋白的黏附活性并初步建立猪肺炎支原体蛋白黏附模型。根据软件分析和文献报道从P216全基因中选取亲水性、抗原性、黏附性较好的目的片段,利用PCR从Mhp NJ株扩增P216基因片段,克隆到表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒pET-32a(+)/P216,经IPTG诱导获得重组蛋白,通过Western blot和间接免疫荧光试验检测重组蛋白的免疫原性及黏附活性。结果表明,PCR扩增的目的基因大小为l 636bp;SDS-PAGE检测重组蛋白相对分子质量为80.1ku;Western blot检测表明重组蛋白能与Mhp阳性血清发生特异性反应;间接免疫荧光试验表明该蛋白对猪肺炎支原体黏附SJPL细胞产生占位抑制作用。结果提示,P216蛋白具有良好的黏附活性,能黏附SJPL细胞,从而为猪肺炎支原体其他黏附因子的研究奠定基础。

猪肺炎支原体感染早期诱导猪呼吸道产生多种特异性IgA抗体分泌规律研究

为了研究猪感染猪肺炎支原体早期,呼吸道针对病原不同功能蛋白分泌特异性IgA抗体的差异与规律,本研究通过已建立的猪肺炎支原体各蛋白的特异性IgA间接ELISA方法,分别检测7头试验猪在感染后第1、2、4、6、8、12、16和21天鼻拭子中抗P36、P46、P97R1的特异性IgA抗体滴度,并经过样品总蛋白浓度校准后,比较3种特异性IgA抗体在感染后21d内的分泌规律。结果显示,在感染后第6天,呼吸道中抗猪肺炎支原体P36、P46、P97R1的3种特异性IgA抗体分泌量均开始上升,于感染后第12天达到高峰,并可持续到第21天,且同1d内3种特异性IgA抗体之间的分泌量差异不显著(P>0.05)。本研究说明在猪肺炎支原体感染的早期阶段,P36、P46、P97R1蛋白均可诱发猪呼吸道产生特异性IgA抗体,且分泌量与分泌规律较为相似,差异不显著。

鸡传染性法氏囊病病毒JSNJ株的分离鉴定及其部分特性研究

从江苏南京疑似传染性法氏囊病病毒感染的鸡场采集病料,通过临床症状、病理剖检变化、人工感染、SPF鸡胚接种、琼脂扩散试验和PCR扩增鉴定等,证实了该鸡场发生了鸡传染性法氏囊病,且从病料中分离到了纯净的传染性法氏囊病病毒。同时,证实该毒株的毒力较强,具有标准毒株的理化特性,免疫原性也比较好。

4株猪肺炎支原体脂膜蛋白对猪肺泡上皮细胞生长抑制作用的比较

比较不同毒力猪肺炎支原体的脂膜蛋白(LAMPs)对猪肺泡上皮细胞生长抑制作用的差异。使用Trion-X114从猪肺炎支原体培养物中提取LAMPs,采用MTT法检测LAMPs对细胞生长的抑制率,观察其对细胞生长状况的影响,并使用Griess试剂对细胞培养物中NO的浓度变化进行测定。结果表明,4株猪肺炎支原体的LAMPs均对猪肺泡上皮细胞SJPL有抑制作用,其抑制作用的强度与猪肺炎支原体的毒力强弱基本相符,即NJ株与168株的抑制作用较强,而168致弱株及J株对SJPL细胞的抑制作用较弱。其中,NJ株的IC50最低,为0.13mg·mL-1;而J株的IC50最高,为0.56mg·mL-1,并且LAMPs可以诱导细胞产生NO。猪肺炎支原体LAMPs对猪肺泡上皮细胞的抑制作用与支原体的毒力相关,强毒株LAMPs的抑制作用较大,而弱毒株的抑制作用较小。

水平井井控井筒压力分布规律研究

水平井发生溢流之后,其井筒流动情况与直井存在较大差别,针对此差别确定水平井压井作业的循环压力,建立水平井井控多相流模型。模型能够模拟水平井压井作业过程中气体在环空的运移规律,以及气侵时间、造斜率、井斜角等因素对节流压力的影响。结果显示,气体在水平段运移对井底压力无明显影响,造斜率越大压井初始时刻节流压力越小,排除溢流时间延迟,最大节流压力偏大。

刚地弓形虫NT株MIC3基因的克隆和原核表达

为构建刚地弓形虫微线体蛋白3(MIC3)原核表达体系,获得高纯度MIC3蛋白用于制备单克隆抗体,评价MIC3蛋白在临床诊断方面的应用价值,根据刚地弓形虫MIC3基因编码的已知序列设计引物,应用PCR技术从刚地弓形虫NT株的基因组DNA中扩增出去除信号肽的MIC3基因,将该基因克隆入pET-32a(+)表达载体,构建pET-32a(+)表达载体,并转化入大肠杆菌(Escherichia.coli)Trans 5α感受态细胞。扩增的MIC3基因与GenBank中相应基因序列(AF509564.1)的同源性达99.9%。将阳性重组表达质粒转化入E.coli BL21-codon plus,经IPTG20℃低温诱导表达,SDS-PAGE分析结果显示,MIC3融合蛋白分子量约为56 000。Western-blotting分析鉴定结果表明,MIC3融合蛋白可被猪抗弓形虫免疫血清所识别。获得的MIC3融合蛋白具有一定的反应原性,为下一步利用重组蛋白建立弓形虫的诊断方法和研制弓形虫的亚单位疫苗奠定了基础。