我国生防微生物代谢产物研发应用进展与展望

中国是一个农业大国,生态环境多样,作物种类繁多,病、虫、草等危害频繁发生。农药是农业生产中必需的生产资料,我国目前使用的农药以化学农药为主、生物农药为辅,为促进生态文明建设和农业可持续性发展,研发和使用无公害的生物农药得到全社会的高度重视。生物农药的定义和范畴因不同国家和不同发展时期稍有不同,主要包括植物源农药、动物源农药、生物化学农药和微生物源农药。

微生物次级代谢产物生物合成基因簇与药物创新

微生物产生众多结构和生物活性多样的次级代谢产物,其生物合成基因簇的克隆是药物创新和产量提高的必要前提。迄今为止已有超过150种生物合成基因簇通过各种方式被克隆,并被用于组合生物合成、体外糖类随机化、代谢工程的定向改造。我们研究室已经克隆并测定了氨基糖苷类井冈霉素/有效霉素、多烯类抗生素FR-008/克念菌素、聚醚类南昌霉素、聚酮类梅岭霉素、杂合聚酮-多肽类口恶唑霉素等生物合成基因簇。深入的基因功能分析揭示了他们独特的生物合成途径和调节机理,为正在进行的组合生物合成结构改造和代谢工程产量提高奠定了基础。

利用氨基酸分子比鉴别放线菌胞壁类型的研究

对已知细胞壁为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型的21株（10属）放线菌进行了胞壁氨基酸组分的分析。结果表明，所有被检测菌株的细胞壁在氨基酸分析仪上均显示有谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和二氨基庚二酸（DAP）。而同一种胞壁类型的菌株，尽管是不同的种或属，氨基酸的总量也各不相同，但这4种氨基酸的分子比却有一个共同而稳定的相似比值，不同的胞壁类型则有不同的比值。从而使每种胞壁类型具有各自的特征，可以作为鉴别的一种有效指标。实验还发现，4株胞壁为111型的弗兰克氏菌以及Ⅳ型的1株诺卡氏菌和1株地中海拟无技酸菌，在薄层层析中除显示有meso-DAP外，尚有甘氨酸；但它们的氨基酸分子比却与Ⅱ型菌株完全不同，分别与Ⅲ型和Ⅳ型菌株相似。这表明，采用分子比鉴别胞壁类型更为精确可靠。

链霉菌低拷贝质粒SCP2的分子生物学

ＳＣＰ２是一个３１ｋｂ的低拷贝链霉菌质粒，ＳＣＰ２＊作为ＳＣＰ２的天然突变体在载体的构建和应用方面得到了广泛的应用。与ＳＣＰ２相比，ＳＣＰ２＊诱动染色体的能力提高了约１０００倍，具有清晰的“麻点”形成特征并在接合时的供受体双方均携带有野生型ＳＣＰ２时没有“进入不利”的属性。通过缺失分析，已确定了与接合转移、麻点形成及质粒稳定性等功能区，对ＳＣＰ２＊的复制功能也进行了深入的研究。本文对ＳＣＰ２分子生物学研究和应用的进展进行系统综述。

微生物药物生物合成途径解析与优化

天然微生物药物的生物合成存在产量低、组分复杂、周期长、严谨调控等特征。同时与药物生物合成相关的催化基因、调节基因、抗性基因和外排基因等成簇排列，初具模块化特征。在充分挖掘、解析和优化多种生物合成元件、模块、系统及高效底盘的基础上，合成生物学整合工程学理念，采用先设计、后实验的策略，修补和强化微生物药物合成机器，高效对接优良底盘，实现微生物药物合成的高产、高效、降耗和减排，最终推动微生物药物产业升级。

我国生防微生物代谢产物研发应用进展与展望

微生物代谢产物农药(microbial metabolite pesticide,简称MMP)是以微生物发酵产生的代谢产物为活性成分,用于防治病虫草鼠等有害生物或促进植物生长发育的生物农药。MMP主要包括农用抗生素、微生物源植物免疫诱抗剂和微生物源植物生长调节剂,是我国应用面积最广的生物农药。部分微生物代谢产物农药兼具预防与治疗效果,是未来绿色农药研发的一个重要方向。本文总结了我国研发和应用的主要代谢产物农药种类、特点和最新研究进展,分析了我国代谢产物农药研发过程中存在的问题和挑战,为新型代谢产物农药的研发与应用提供参考。

2015年中国微生物遗传学研究领域若干重要进展

中国微生物遗传学研究在2015年取得了重要进展。本文回顾了2015年度中国本土科研团队在微生物遗传学领域取得的若干重要科研进展,扼要介绍了若干重点论文,展示了中国科学家在本领域的学术贡献。在基础微生物遗传学领域,明确了调控基因表达的一系列重要生物大分子的组成、结构和功能,解析了微生物免疫系统识别外源核酸片段的分子基础,阐明了多个微生物来源重要活性物质的生物合成途径及新颖的酶学反应过程,发现了微生物基因表达调控的新机理,在微生物发育、进化与群体行为生物学方面也取得一定进展。在工业微生物遗传学方面,阐明了微生物制造及其分子基础。在病原微生物遗传学方面,研究了多个致病菌的遗传调控,明晰了致病菌?宿主相互作用的遗传机制,在基因组水平解析了微生物耐药、新发病原和环境微生物的遗传机理,为致病菌防控新措施的研发提供了基础。在微生物多样性与环境微生物遗传学方面,展示了利用微生物遗传多样性的特点通过催化获得特定手性的化合物具有较好应用前景,肠道微生物组学研究方兴未艾。

井冈霉亚基胺A高产突变株的构建

通过接合转移将一个带有阿泊拉抗性基因和双交换臂的穿梭质粒pJTU609导入井冈霉素高产菌株吸水链霉菌井冈变种(Streptomyces hygroscopicusvar.jinganggensis)DX546中,将负责井冈霉素A生物合成最后一步糖基转移中的糖基转移酶基因valG置换突变,多聚酶链式反应结果显示valG被阿泊拉霉素抗性基因成功置换,通过高压液相色谱检测证实突变株的发酵产物中井冈霉亚基胺A的产量得到大幅提高.

微生物药物产生菌功能基因组学研究进展

微生物药物是一类化学结构和生物活性多样的次级代谢产物,近年来其多个产生菌基因组序列已经被测定完成,在此基础上开展的功能基因组研究方兴未艾,并在抗生素生物合成、形态分化、调控、系统发育与进化以及次级代谢产物挖掘等方面有着新的发现,展现出广阔的研究前景。本文重点阐述了四种重要抗生素产生菌功能基因组学的研究现状,集中于青霉素高产的遗传机制、红霉素产生菌红色糖多孢菌基因组与转录组分析、链霉素产生菌灰色链霉菌中A因子调控网络、阿维菌素产生菌作为次级代谢物异源表达的通用宿主与超高产菌株构建以及新型天然产物的挖掘等研究内容,同时简要介绍了当前我国微生物药物产生菌基因组学的研究概况,并从基础与应用两个角度对其未来发展趋势进行了展望。

内生放线菌A00122中germicidin生物合成基因的克隆

在植物和细菌中,Ⅲ型聚酮合酶能够产生种类多样的次生代谢产物.在药用植物内生放线菌A00122的发酵产物中,分离到了一个已知的Ⅲ型聚酮类化合物germicidin.对A00122菌株建立了基因组文库,根据已知的同源基因Sco7221设计引物作为探针对文库进行PCR筛选,并通过Southern杂交的方法从阳性克隆5-3-10中定位了包含germi-cidin基因的片段,经测序得到长度为1 185 bp的完整合成基因.该基因的获得为深入研究Ⅲ型聚酮合酶的底物选择性,通过定向改造的方法获得非天然Ⅲ型聚酮类化合物提供了重要基础.

在变铅青链霉菌基因组中定域克隆外源DNA的置换性载体及通过反选择获得重组体的模式方法

ΦＨＡＵ３Ｒ是变铅青链霉菌６６中对噬菌体ΦＨＡＵ３显示抗性的基因，已从基因组中获得分离。将基因组中邻近于该基因两侧的一个３５ｋｂ和另一个３８ｋｂ的ＤＮＡ片段分别以其在染色体上的天然取向插入到一个由ｐＩＪ１０１衍生的质粒ｐＩＪ６５３上，构建成ｐＨＺ８０６。然后在ｐＨＺ８０６上对应于ｐＩＪ１０１复制子的区域中插入一个ｓｐｃ／ｓｔｒ抗性基因，同时在３５ｋｂ和３８ｋｂ片段之间插入一个潮霉素抗性基因（ｈｙｇ），衍生出一个新质粒ｐＨＺ８０８。由于ｐＨＺ８０８中不具有完整的ｐＩＪ１０１复制功能区，所以它不能在链霉菌中复制。然而，在该质粒３５ｋｂ和３８ｋｂ片段之间插入的任何ＤＮＡ片段，在导入到变铅青链霉菌中后都可借助于３５ｋｂ和３８ｋｂ两个片段与内源染色体的同源区域所发生的双交换而稳定地整入到内源染色体的特定区域（３５ｋｂ和３８ｋｂ片段之间），同时置换出染色体上的ΦＨＡＵ３Ｒ基因。发生了这种基因置换的重组子菌株会对噬菌体ΦＨＡＵ３变得敏感，这种反选择方法可用来浓缩和初选携带定域插入片段的重组子。已利用潮霉素抗性基因（ｈｙｇ）作为一个模式基因片段阐明了这种载体和这种在染色体上定域克隆外源基因片段的方法学和?

抗生素生物合成调控元件的功能解析

抗生素生物合成的整个过程由多个环节构成,受到前体物供给、装配、外运、调控和抗性等因素的影响,因此形成了相应的各种生物合成元件和模块。其中最为重要的是控制生物合成基因转录和翻译等表达水平的调控蛋白及其机制。放线菌的调控蛋白有全局性、多效性和途径专一性三种类型,并形成复杂的级联调控网络,对抗生素的合成实施严谨的控制。调控基因的功能鉴定和调控机理的解析是定向提高生物合成基因转录水平和抗生素产量的重要前提,也是构建抗生素高效合成的放线菌底盘生物的必要基础。在该研究执行的前两年,本研究重点对纳他霉素产生菌和天蓝色链霉菌的多个重要调节基因及其调控机制展开了深入的研究。抗生素生物合成途径优化的重要策略之一是提高生物合成基因及其编码蛋白的表达水平,因此,解析抗生素生物合成的调控机制是实施该策略的重要前提。该研究对恰塔努加链霉菌和天蓝色链霉菌中跟那他霉素、十一烷基灵菌红素和放线紫红素相关的多个途径专一性基因和多效性基因进行了功能鉴定,揭示了放线菌抗生素生物合成复杂而特别的调控机制,为途径优化和优良底盘生物的构建奠定了基础,而且通过调控基因的改造显著提高了抗生素的产量或缩短了发酵周期,已经初步显示出改造调节基因是提高抗生素产量的重要合成生物学策略。

奇迹束丝放线菌合成安丝菌素过程中支链氨基酸的添加效果分析

安丝菌素是一类重要的聚酮抗生素,由AP-1,AP-2,AP-3,AP-3′和AP-4 5个组分组成,其中AP-3的活性最强,通常作为发酵的目标产物。奇迹束丝放线菌合成安丝菌素的摇瓶实验发现,添加支链氨基酸(BCAAs)可明显影响安丝菌素的产量以及组分。为了进一步验证支链氨基酸对安丝菌素生物合成的作用,选用合成培养基并在不同时段添加支链氨基酸进行发酵实验,实验结果显示,发酵48h后加入0.5g/L缬氨酸(Val)能使AP-3增产1倍左右;而在同一时刻添加等量的亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)对AP-3的抑制作用较明显,产量分别下降了58.8%和83.3%,且添加Leu和Ile分别使得AP-4与AP-2组分增加。此外,添加Ile可使琥珀酸与乙酸的积累量都明显上升,而添加Val使得细胞分泌琥珀酸和乙酸明显变少,这意味着奇迹束丝放线菌代谢支链氨基酸不仅影响对聚酮途径以及侧链合成,对细胞的代谢状态也有一定影响。

大肠杆菌-链霉菌高效接合载体的构建及其应用

以链霉菌质粒SCP2 的衍生质粒pHJL4 0 0为基础 ,构建了能够在大肠杆菌到链霉菌之间进行高效接合转移的质粒pGH112。pGH112含有在大肠杆菌和链霉菌中复制起始位点 ,以及分别在大肠杆菌和链霉菌中进行筛选的抗性标记。用pGH112转化EscherichiacoliET12 5 6 7(pUZ80 0 2 )后 ,与天蓝链霉菌 (StreptomycescoelicolorA3(2 ) )、除虫链霉菌 (Streptomycesavermitilis)、变铅青链霉菌 (StreptomyceslividansTK5 4 )、毒三素链霉菌 (StreptomycestoxytriciniNRRL15 4 4 3)、委内瑞拉链霉菌 (Streptomyces.venezuelaeISP5 2 30 )和红色糖多孢菌 (Saccharopolyporaerythraea)进行接合 ,发现本文构建的pGH112与pKC1139相比 ,接合转移效率较高 ,稳定性好 ,而且宿主范围较广。把组成型启动子ermE 与绿色荧光蛋白基因 (gfp)克隆到本文构建的pGH112 ,通过接合转移到链霉菌中 ,gfp获得表达 ,证明其可以用作基因接合转移的有效工具载体 。

聚合酶链式反应递缩基因组文库以克隆抗生素生物合成基因簇

在克隆阿维菌素(avermectin)生物合成基因簇的过程中,探索出了一条运用聚合酶链式反应(PCR)扩增技术对链霉菌基因组文库进行递缩法筛选、以克隆抗生素生物合成基因簇的新方法.依次以96孔培养板整板混合质粒、单排混合质粒和单个菌落为模板进行PCR扩增,以逐步递缩的方式定位包含目的基因的克隆.结果表明,与传统的菌落原位杂交方法相比,该方法具有简单、快捷、准确率高等优点.

林可霉素转运蛋白基因lmrC的功能分析

为了研究腺苷三磷酸结合盒转运蛋白LmrC是否参与林可霉素的生物合成,通过同源重组在林可霉素高产菌株LC-G中构建了lmrC的缺失突变株XJJ7.高效液相色谱(HPLC)分析和抗性检测显示,相比出发菌株LC-G,XJJ7的林可霉素产量下降了55%,而且耐受林可霉素的最高质量浓度降低了50%.进一步实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析发现,突变株XJJ7中林可霉素生物合成基因lmbA和lmbR的转录明显低于LC-G,但调控基因lmbU的转录不变.在LC-G中lmrC的过表达不能进一步提高产量,也不影响lmbA、lmbR和lmbU基因的转录,但过表达菌株对林可霉素的抗性显著增强.结果表明,lmrC可以通过影响生物合成基因的转录来调节林可霉素的产生,并赋予产生菌一定的抗性.

曲张链菌素产生菌壮观链霉菌NRRL2494菌株遗传操作体系的建立

曲张链菌素属于安莎类抗生素,具有显著的生物活性.在从壮观链霉菌NRRL2494菌株的发酵产物中分离和鉴定了多组分曲张链菌素的基础上,探索和优化了外源DNA通过接合转移进入壮观链霉菌NRRL2494菌株的操作方法和培养条件.以游离型质粒pJTU1278为载体,在体外构建了一个曲张链菌素酰胺合酶基因svaF敲除的质粒,通过接合转移转入到壮观链霉菌NRRL2494野生型菌株中,所获得的svaF基因缺失突变株失去了产生曲张链菌素的能力.该遗传操作体系的成功建立和优化,使得在体内分析和鉴定曲张链菌素生物合成基因的功能成为可能,同时也为建立其他类似放线菌的遗传操作体系提供了参考.

阿维链霉菌中转录因子AveR对阿维菌素生物合成的正调节

aveR是阿维链霉菌NRRL 8165阿维菌素生物合成基因簇中唯一可能的调节基因.为了验证aveR是否参与阿维菌素生物合成基因的转录调节,构建了用于敲除aveR的基因置换质粒pJTU2530,并通过接合转移引入了阿维链霉菌.通过筛选ThioSAprR转化子,经聚合酶链式反应(PCR)扩增验证,获得了aveR内部1 320 bp区域被阿泊拉霉素抗性基因aac(3)IV替换的突变株ZD10.高压液相色谱检测表明,与野生型菌株相比,突变株ZD10不再产生阿维菌素,并且ZD10中寡霉素的产量明显高于野生型菌株.进一步的反转录PCR(RT-PCR)分析表明,与野生型菌株相比,突变株ZD10的聚酮合酶基因aveA3不再转录.结果显示,AveR是阿维菌素生物合成的正调节因子,通过调节结构基因的转录表达来影响阿维菌素的产生.

聚醚类抗生素的研究进展

聚醚类抗生素是由链霉菌产生的一类重要的Ⅰ型聚酮类化合物,具有广泛的用途。这类抗生素的生物合成途径是先合成一个聚酮链的多烯前体,然后通过一系列后修饰反应形成最终产物,在后修饰反应中,几个最关键的步骤已经得到了很好的阐明,这些步骤包括环氧键的形成、水解和最终的成醚,这些合成步骤在所有已知基因簇的聚醚类抗生素中是相当保守的。在结合本实验室研究的基础上,总结了近几年来国际上对聚醚类抗生素研究的最新进展,概述了聚醚类抗生素的生物合成途径。

大型真菌来源鸟巢烷型二萜研究进展

鸟巢烷型二萜是大型真菌来源二萜化合物中最大的类群,其化学结构特征是包含5/6/7元环杂合的三环骨架。由于鸟巢烷型二萜具有以刺激神经生长因子合成为代表的多种生物活性,其人工合成和相关药物开发引起了广泛关注。总结近年来报道的来源于黑蛋巢菌属(Cyathus)、猴头菌属(Hericium)和肉齿菌属(Sarcodon)等大型真菌的多种鸟巢烷型二萜的化学结构和生物活性,介绍其化学合成和生物合成方面的研究进展。