口服轮状病毒活疫苗LLR-85株的选育及鉴定

一株羊轮状病毒经初生小牛肾原代细胞传代，定名为LLR－85株。按Jennerian种痘法的原理，取第37代和第19代毒种，作为人用口服轮状病毒活疫苗的候选疫苗株。疫苗株电镜检查形态典型，抗原鉴定为A群、亚群Ⅰ、血清型G10和P12。电泳型为长型，11条带。病毒滴度可达105.0～7.0TCIDEA50。经无菌试验、支原体检查、外源因子检查及动物安全试验等项目检定，均符合我国规程要求。疫苗株遗传性状稳定，有望用于婴幼儿轮状病毒急性腹泻的预防。

轮状病毒DNA疫苗的制备及其抗体应答

将轮状病毒G1型Wa株的Vp7基因克隆到真核表达载体pCDNA3 1(+)中 ,经Sepharose CL4B柱层析 ,获得纯化的质粒 ,通过肌肉注射和皮下注射 ,免疫BALB c及F1小鼠后 ,产生了抗轮状病毒Wa抗体。其中F1小鼠的抗体应答高于BALB c小鼠。肌肉注射优于皮下注射。

口服轮状病毒活疫苗LLR-85-37株反应及血清学效果初步观察

应用轮状病毒活疫苗LLR-85株第37代毒种，即LLR－85－37株，接种成人10人，3～6岁小儿21人，6月龄～2岁婴幼儿15人，口服一次，剂量为3×106.0TCIDEA50／ml。所有服苗者均反应轻微，未见发热、腹泻和呕吐等症状。轮状病毒1，2，3，4各型血清中和抗体4倍增长阳性率：3～6岁小儿组（20人）分别为55.0％，50.0％，63．6％和40．0％，对照组13人为0％；6月龄～2岁婴幼儿组（13人）分别为38．5％，69．2％，3％和53.8％，对照组15人为0％。初步观察结果表明LLR－85－37株口服轮状病毒活疫苗是安全、有效的。

丙肝核酸疫苗免疫的CTL活性检测

目的 :探讨丙肝核酸疫苗的细胞免疫应答效果。方法 :用丙肝核酸疫苗pSVL HCV C +E1 通过皮下注射途径免疫BALB C小鼠 ,以绿色荧光载体重组体pEGFP N1 HCV C +E1 转染的小鼠骨髓瘤细胞SP2 0作为靶细胞 ,采用51 Cr释放法 ,以(Na) 2 51 CrO4 标记靶细胞进行标准的 4h杀伤试验检测其CTL活性。结果 :CTL杀伤率达 4 0 7%。结论

丙型肝炎病毒核酸疫苗的免疫效果观察

将丙型肝炎病毒Ｃ＋Ｅ１区基因克隆到不同的真核细胞表达载体ｐＣＤＮＡ３．１（＋）和ｐＳＶＬ中，通过肌肉注射和皮下注射免疫ＢＡＬＢ／Ｃ及Ｆ１小鼠后，产生了抗ＨＣＶ／Ｃ区抗体。其中核酸疫苗ｐｃＤＮＡ３．１－ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１的免疫高峰的出现早于ｐＳＶＬ－ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１，Ｆ１小鼠的抗体应答强于ＢＡＬＢ／小鼠。肌肉注射优于皮下注射。

凝血酶冻干制剂冻干工艺选择研究

在对凝血酶精制、制剂配制、稳定剂选择和冻干工艺试验、冻干制剂稳定性等进行了一系列的试验之后,建立了凝血酶冻干制剂的活性单位检测方法,得到了凝血酶冻干制剂(速效局部止血药200IU/ml和500IU/ml)的试制结果.在选定的制造工艺条件下,连续生产三批,经甘肃省药品检验所检定结果,无菌试验合格,单位含量合格并相当于标示量的100%～140%,比活高于10IU/mg,残余水份含量低于3%,制剂质量均达到2005版药典标准的要求.凝血酶冻干制剂的稳定性良好,37℃保存三个月后标示量下降在10%以内.

用T-A载体克隆技术构建丙肝病毒C+E1区真核表达质粒pSVL-HCV/C+E1

用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄＩＩ将丙肝病毒Ｃ＋Ｅ１ＤＮＡ片段从其克隆载体ｐＧＥＭ３ｚｆ－ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１上切下，经Ｔａｑ酶补齐３’末端后插入到载体ｐＳＶＬ－Ｔ中，构建成丙肝病毒Ｃ＋Ｅ１真核表达载体ｐＳＶＬ－ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１。本实验中重组效率达６４．７％（１１／１７），正向插入为５０％（２／４）。

流行性感冒灭活疫苗的研制

将流感病毒接种于鸡胚尿囊腔培养，收集鸡胚尿囊液及羊水，经甲醛灭活后，采用蔗糖速率区带超离心的方法进行提纯经脱糖、紫外照射后，按照《ＷＨＯ生物制品规程》的要求，试制出含有Ａ１型。

轮状病毒基因重配株血清型鉴定方法的研究

Ａ组轮状病毒中根据基因９的不同目前至少已发现有１３个不同Ｇ血清型，其中能引起人类致病的有Ｇ１－Ｇ４，Ｇ８，Ｇ９和Ｇ１２型。建立可靠的血清型鉴定技术对于轮状病毒疫苗的研制和分子流行病学的研究具有重要意义。本文首次报导了一种鉴定轮状病毒Ｇ血清型的新方法，利用已知有关轮状病毒ＶＰ７基因的序列资料，设计合成了一套鉴定轮状病毒Ｇ血清型的寡核苷酸探针，利用地高辛标记上述探针。待检品经反转录ＰＣＲ扩增后与上述一套寡核苷酸探针分别进行杂交得以确定其血清型。这一方法与目前常用的套式ＰＣＲ方法相比更适合于大量样品的操作而且结果可靠。用这一方法对本实验室组建的四株基因重配疫苗株进行实验，其结果与套式ＰＣＲ方法完全一致。

用逆转录套式PCR检测临床标本中的腮腺炎病毒RNA

流行性腮腺炎是儿童常见呼吸道传染病，并发症多为睾丸炎、无菌脑炎等。个别患者甚至因严重的脑炎并发症而死亡［１］。故有必要对患者进行早期病原诊断，以利于早期治疗。腮腺炎病毒ＲＮＡ中小疏水蛋白（ＳＨ）基因作为高变区在不同毒株的分子特性鉴别中比其它基因片段更...

地高辛标记核酸探针斑点杂交法检测轮状病毒疫苗中残余MA－104细胞DNA含量的研究

本文报导用地高辛标记核酸探针和分子斑点杂交技术检测轮状病毒基因重配株Ｌ－３株活疫苗中残余ＭＡ－１０４细胞ＤＮＡ含量的方法。提取和纯化ＭＡ－１０４细胞ＤＮＡ，将其ＡｌｕＩ酶切片段用随机引物法引导ＤＮＡ标记为探针。待检样品抽提核酸后点膜进行斑点杂交。此法灵敏度高，可检出０．１４ｐｇ的ＤＮＡ，特异性强，与非同源性ＤＮＡ无杂交。用此法检测轮状病毒基因重配株Ｌ－３株制备的疫苗，ＭＡ－１０４细胞残余ＤＮＡ含量低于１４ｐｇ低于ＷＨＯ限量标准，结果表明此重配株用于研制疫苗是安全的。

区带超速离心提纯流感病毒的初步探讨

在制备灭活流感疫苗中，采用两次蔗糖速率区带超离心从流感病毒感染的鸡胚尿液中提纯流感病毒是较简便、实用的方法，根据流感病毒分子特性设计了超离梯度并采用适当试验条件，获得了大量提纯流感病毒的初步结果。经血凝、电镜、蔗糖浓度、浮力密度等检验证明此方法是可行的。

两株中国腮腺炎野毒SH基因cDNA直接测序和克隆测序

对来源于兰州和上海两市的两株腮腺炎病毒野毒的小疏水蛋白（ＳＨ）基因及其旁侧区ｃＤＮＡ的ＰＣＲ扩增产物，分别进行直接测序和克隆测序。用直接测序法测定２株腮腺炎野毒３７８个核苷酸序列，在此范围内存在１６个核苷酸（４．２％）差异，其中１１个（２．９％）位于编码区序列中，所推导的ＳＨ蛋白序列有６个氨基酸（１０．５％）差异。克隆测序法测定的这两株腮腺炎野毒的核苷酸序列相当于直接法的７８－３７８位核苷酸。两种方法在所测３０１个核苷酸（ｎｔ）的共同区域内序列完全一致。证明ＰＣＲ产物直接测序用于腮腺炎病毒分子流行病学研究不仅特异性强，敏感度高，而且比克隆测序法更为快速简便。

多抗原肽在抗HCV血清学诊断中的应用

应用八分支的多抗原肽（Ｍｕｌｔｉｐｌｃａｎｔｉｇｅｎｉｃｐｅｐｔｉｄｅ，ＭＡＰ）树脂，通过固相肽合成技术，合成一系列源于ＨＣＶ核心蛋白和ＮＳ４蛋白的八分支多抗原肽。经ＥＬＩＳＡ检测表明，八分支多抗原肽具有较强的免疫反应性。与相应的单拷贝寡肽相比较，多抗原肽对弱阳性血清的检出率有所提高。中和ＥＬＩＳＡ试验也表明，多抗原肽与抗体的亲合力及包被效率均优于单拷贝寡肽。多抗原肽不仅可以提高检测的灵敏度和可靠性，而且可以降低抗原的包被浓度，故在抗ＨＣＶ血清学诊断中具有一定的应用优势。

丙型肝炎病毒核心区优势抗原表位基因的化学合成及其表达产物的抗原性分析

依据丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）多蛋白核心区Ｎ端氨基酸序列和密码子简并性，人为设计并采用半化学半酶促的方法合成了一个ＤＮＡ片段。经核酸杂交检测以及ＤＮＡ序列分析证实，该片段的核苷酸序列与设计完全一致。将合成的ＤＮＡ片段插入融合表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ中，表达产物经亲和层析纯化后进行Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹实验和间接ＥＬＩＳＡ分析，结果表明，融合蛋白具有ＨＣＶ核心区抗原的免疫反应性，可望用于ＨＣＶ抗体的检测．此外，编码ＨＣＶ优势抗原表位的化学合成基因有可能为ＨＣＶ嵌合抗原的研究提供一条捷径。

一株腮腺炎野毒分离传代前后其SH基因cDNA的测序比较

为证实鸡胚分离传代是否引起腮腺炎病毒基因组高变区小疏水蛋白（ＳＨ）基因的变异，用来源于上海的腮腺炎野毒Ｗｓｈ３株在鸡胚尿囊腔分离前和传代５次后测定ＳＨ基因及其旁侧区３８０个核苷酸的ｃＤＮＡ序列，两者结果相同，未见该基因的突变。该基因核苷酸测序可用于腮腺炎病毒的分子流行病学和毒株基因鉴别研究。

用核酸免疫技术制备抗丙肝病毒C区单克隆抗体

用丙肝病毒Ｃ＋Ｅ１区真核表达质粒ｐｃＤＮＡ－ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１按４００ｕｇ／只剂量免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，１４周后同一剂量再加强免疫一次。加强免疫后２周，在５０％ＰＥＧ１４５０介导下将脾细胞与ＳＰ２／０小鼠骨髓瘤细胞（５１）融合。实验结果融合率达５４．３％（３１３／５７６）。阳性率为５．４％（１７”３１３）。克隆化后得到６株稳定分泌抗丙肝病毒Ｃ区单克隆抗体杂交瘤细胞株。这６株杂交瘤均产生ＩｇＭ抗体，接种ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠后产生腹水的效价为１６４－１３２０（ＥＬＩＳＡ）。

丙肝核酸免疫效果初步观察

目的 观察丙肝核酸疫苗的免疫效果。方法 用丙肝病毒C +E1区基因的真核表达重组质粒pSVL HCV/C +E1免疫蛇毒预处理的BALB/C和C57BL小鼠 ,两周后采用ELISA法开始检测抗体滴度。结果真核表达重组质粒pSVL HCV/C +E1免疫能诱导小鼠免疫应答 ,产生高水平的特异抗体。特别是C57BL小鼠抗体反应最好 ,初次免疫就能产生高水平的特异抗体 ,加强后能持续数周 ,最高滴度OD值达 1 4 5。结论 说明丙肝核酸免疫能够诱导高水平的体液免疫。

免疫聚合酶链反应技术的建立及其对甲胎蛋白的检测

免疫ＰＣＲ是一种新的具高敏感性的抗原检测技术，它类似传统的ＥＬＩＳＡ法，若与抗体连接的酶用ＤＮＡ片段代替，则该ＤＮＡ片段可用于ＰＣＲ扩增。以链酶亲合素搭桥将生物素标记的抗体与ＤＮＡ相连建立了免疫ＰＣＲ技术，并将其用于检测甲胎蛋白（ＡＦＰ），其敏感性比ＥＬＩＳＡ法高１０４。因此。