探针导向重组酶介导等温扩增法检测MTB rpoB基因突变的应用价值

目的建立可快速检测MTB rpoB基因516位点突变的探针导向重组酶介导等温扩增法(probedirected recombinase amplification,PDRA)。方法设计4条探针[1条野生型探针(P-W)及3条突变型探针(P-GGC、P-GTC、P-TAC)]和1条共同的下游引物,分别构建TB-516-W、TB-516-GGC、TB-516-GTC和TB-516-TAC4种检测体系,在39℃条件下恒温扩增40 min。通过阳性阈值时间判定MTB rpoB基因516位点是否发生突变及其突变类型;通过同一探针检测对应的重组质粒确定该检测体系的敏感度;通过不同探针检测某一种重组质粒,根据阳性阈值时间确定该检测体系的特异度。应用建立的PDRA方法检测6株利福平耐药MTB菌株和35份MTB培养阳性的痰标本,并与一代测序结果进行比较。结果 4种检测体系检测对应重组质粒的敏感度为1000拷贝/μl。4种检测体系的特异度良好,探针与靶序列完全匹配时,阳性阈值时间早;探针与靶序列不完全匹配时,阳性阈值时间晚,具有稳定的阳性阈值时间差值,体系TB-516 W,TB-516-GGC,TB-516-GTC和TB-516-TAC的阳性阈值时间差值分别为7.0、5.8、10.0、7.0 min。PDRA检测6株MTB利福平耐药菌株和35份MTB培养阳性痰标本的结果与测序结果一致。结论本研究初步建立了可应用于MTB利福平耐药rpoB基因516位点突变检测的PDRA方法,该方法检测敏感度高,特异度好,具有一定的实验室应用价值。

病毒性脑炎患者脑脊液和血清配对标本疱疹病毒和肠道病毒的检出率比较分析

目的比较病毒性脑炎患者脑脊液、血清配对标本中疱疹病毒属病毒,肠道病毒的检出率。方法采集2017年12月至2018年2月湖南省长沙市儿童医院诊断疑似病毒性脑膜炎患儿109例脑脊液、血清配对标本,采用一步法巢式实时荧光定量RT-PCR和实时荧光定量PCR法分别进行肠道病毒和疱疹病毒属病毒检测,分析不同标本类型病毒检出率。运用SPSS17.0对检测结果进行统计分析。结果109例患者的配对标本人疱疹病毒6型(human herpes virus type 6, HHV6)、单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)、EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)、肠道病毒(Enterovirus group A type 71,EV-A71)血清阳性率分别为7.34%、4.59%、7.34%、9.17%、10.09%,脑脊液阳性率分别为5.50%、2.75%、0、5.50%、6.42%。结果显示两种类型标本病毒检测结果的差异有统计学意义(P<0.05)。在脑脊液和血液样本中,可检出EV-A71病毒阳性的最长时间分别为发病后2 d和7 d,可检出CMV病毒阳性的最长时间分别为发病后3 d和26 d,可检出HHV6病毒阳性的最长时间分别为发病后7 d和8 d,可检出HSV1病毒阳性的最长时间均为发病后12 d;在血清样本中,可检出EBV病毒阳性最长时间为发病后10 d,而脑脊液样本在发病10 d内均无法检出该病毒。结论EV-A71是导致该地区病毒性脑炎的最主要的病原体,血清标本病毒总体阳性率高于脑脊液标本。血清内脑炎相关的大多数病毒的存活时间较长于脑脊液中。提示对于病毒性脑炎患儿病原检测,时间具有重要意义,可根据发病时间合理选择标本类型进行测定。

丙型肝炎病毒核酸检测技术研究进展

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)在全球感染超过2亿人,发病率不断上升,给资源贫乏的国家造成沉重的经济负担。有效的HCV诊断对治疗选择和治疗监测有指导意义。HCV感染检测技术包括血清学检测和核酸检测。血清学检测主要用于HCV感染筛查,操作简便,但窗口期长,不能判断病毒活动期或是既往感染。核酸检测灵敏度高,线性范围广,是确定病毒感染的直接证据。传统的变温核酸扩增技术已广泛应用于临床实验室。等温核酸扩增技术的发展克服了传统核酸扩增技术的局限性,可作为现场即时检验(point-of-care testing,POCT)的工具,能够满足我国基层医疗卫生机构乃至非洲和东南亚等HCV流行率高的低资源地区的需求。本文综述了HCV核酸检测技术的研究进展并展望了其发展趋势。

3型腺病毒免提取核酸重组酶介导的等温扩增实时荧光检测方法的建立及应用

目的 建立3型腺病毒(human adenovirus 3,HAdV-3)免提取核酸的重组酶介导的等温扩增(recmbinase acid amplification,RAA)实时荧光检测方法。方法 根据HAdV-3基因保守序列分别设计1对引物和1条探针,通过对免提核酸的条件摸索和优化,建立1种免提取核酸,重组酶介导的等温扩增实时荧光检测方法;通过对培养的毒株进行系列稀释,免提取核酸分析该方法的灵敏度;通过检测其他呼吸道病毒的原始样本,评价该方法的特异性;并检测HAdV-3临床样本,与传统的提核酸实时荧光定量PCR方法进行比较。结果 本研究建立的免提取核酸实时荧光RAA方法对10倍系列稀释的HAdV-3毒株进行检测,和实时荧光定量PCR方法相比,灵敏度相当,对应的最低浓度稀释样本的Ct值为36.87,对常见其他型别的呼吸道病毒检测无交叉反应。两种方法对56例HAdV-3阳性临床样本同时检测,结果完全一致。结论 本文首次报道了免提取核酸的实时荧光RAA检测HAdV-3的方法,该方法具有较高的灵敏度和特异性,适合应用于临床实验室及基层单位快速检测HAdV-3。

实时荧光逆转录重组酶介导的等温扩增技术检测寨卡病毒方法的建立

目的建立一种实时荧光逆转录重组酶介导的等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)技术检测寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)的方法,以实现ZIKV的现场快速筛查及诊断。方法通过基因组序列比对,选择ZIKV保守序列设计RT-RAA特异性引物和探针,并用系列稀释的ZIKV重组质粒与毒株核酸验证方法的灵敏性与重复性,通过检测登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒等其他虫媒病毒验证方法的特异性。结果建立的RT-RAA方法可在39℃恒温条件下30 min内对ZIKV进行高效扩增,检测系列稀释的ZIKV重组质粒,其95%检测限可达到15拷贝/反应,特异性强,与登革病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒虫媒病毒无交叉反应,且重复性好。结论本研究建立的ZIKV的RT-RAA等温扩增方法,具有反应迅速,无需精密仪器,操作简单等优点,适合于应急快速检测。