基于FoxO1通路探讨仙茅苷对H2O2诱导成骨细胞氧化损伤的保护作用及机制

目的探讨仙茅苷(Curculigoside)对H_2O_2诱导成骨细胞氧化损伤的保护作用及机制。方法采用H_2O_2(0.3 mmol·L^(-1))处理MC3T3-E1成骨细胞建立细胞氧化损伤模型,并以阳性对照药氮乙酰半胱氨酸(NAC,2.5 mmol·L^(-1))和不同浓度仙茅苷(10^(-6)、10^(-7)、10^(-8)mol·L^(-1))进行干预。采用MTT法检测成骨细胞的增殖情况;磷酸苯二钠法(p-PNPP-Na)法测定成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性;茜素红染色法观察成骨细胞的骨矿化结节形成情况;ELISA法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力;流式细胞仪检测细胞活性氧(ROS)和线粒体膜电位;Western Blot法检测细胞叉形头转录因子1(FoxO1)和SOD-2的蛋白表达水平;免疫荧光组织化学法检测FoxO1、活化转录因子4(ATF4)、β-连环蛋白(β-catenin)在细胞核中的表达。结果与空白对照组比较,模型组成骨细胞在H_2O_2处理36~72 h后,MC3T3-E1细胞的增殖受到显著抑制(P<0.001);成骨细胞活力及ALP活性均明显降低(P<0.05),细胞形成的骨矿化结节的数量和面积明显减少;SOD活性明显降低(P<0.05),CAT活性明显增加(P<0.05);ROS水平增加,线粒体膜电位降低,总FoxO1a、SOD-2蛋白表达下调,FoxO1a在细胞核内的表达下调,在细胞质中的表达上调,在细胞核与细胞质表达的比例降低,但差异没有统计学意义(P>0.05);细胞核中FoxO1a、β-catenin、ATF4表达量升高。与模型组比较,阳性药组和不同浓度仙茅苷组的成骨细胞活力及ALP活性均明显上调(P<0.05),且细胞骨矿化结节的数量和面积明显增加;阳性药组及仙茅苷10^(-6)mol·L^(-1)组的细胞SOD活性明显增加(P<0.05),仙茅苷10^(-6)mol·L^(-1)组细胞的CAT活性明显增加(P<0.05);10^(-7)mol·L^(-1)仙茅苷组细胞的ROS水平明显降低(P<0.05);仙茅苷10^(-8)mol·L^(-1)组的线粒体膜电位明显升高(P<0.05);阳性对照组和10-6mol·L^(-1)仙茅苷组的细胞总FoxO1a蛋白表达明显上调(P<0.05);各给药组细胞的SOD-2蛋白表达均明显上调(P<0.05);10^(-6)mol·L^(-1)仙茅苷组细胞FoxO1a在细胞核与细胞质表达的比值明显升高(P<0.05);10^(-6)mol·L^(-1)仙茅苷组细胞的FoxO1a、ATF4在细胞核的表达上调,β-catenin在细胞核的表达没有明显变化。结论仙茅苷能够保护H_2O_2对MC3T3-E1成骨细胞的氧化损伤,可能与其增加FoxO1在细胞核内的表达,增强FoxO1a与ATF4相互作用,以及增强SOD及CAT活性有关。