人免疫缺陷病毒1型TAT突变蛋白及反义TAT RNA对TAT反式激活作用的抑制

Ｔａｔ（Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ）是人免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）基因组编码的反式激活因子，突变分析表明它含有几个重要的功能域。为寻找控制ＨＩＶ复制的途径，构建了以ＨＩＶ－１ＬＴＲ（－１５８－＋８０）为启动子的ＴａｔｃＤＮＡ全长反义表达质粒ｐＡＳ－Ｔａｔ，并用已经构建的以ＨＩＶＬＴＲ－１５８到＋８０为启动子，具有不同突变点的突变Ｔａｔ基因表达质粒，以荧光酶基因为报告基因，共转染Ｊｕｒｋａｔ细胞，结果发现无论是反义Ｔａｔ表达质粒还是突变Ｔａｔ表达质粒，在瞬时转染体系中均能不同程度地抑制Ｔａｔ的活性，其中以ｐＭ５（５２位Ａｒｇ由Ｌｅｕ替代）和反义ＴａｔＲＮＡ的抑制效果最好。结果说明。

HL－60细胞诱导分化过程中TPK和PTPP活力的时空改变

对ＲＡ、ＨＨＴ和ＷＰ_（８５２）诱导ＨＬ－６０细胞分化过程中胞浆和膜溶脱部分中的ＴＰＫ和ＰＴＰＰ活力变化进行了研究．结果表明，在诱导早期，ＴＰＫ的活力就有明显的波动变化；随着诱导时间的延长，胞浆部分ＴＰＫ活力下降，膜溶脱部分的ＴＰＫ活力则升高．诱导后，胞浆部分和膜溶脱部分的ＰＴＰＰ活力均明显升高。与ＴＰＫ活力变化相比较，ＰＴＰＰ变化幅度比ＴＰＫ的大。

人免疫缺陷病毒1型TAT蛋白点突变对其反式激活作用的影响

不同免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１，ＨＩＶ－２和ＳＩＶ）的Ｔａｔ均有３个高度保守的结构域：Ｃｙｓ富集域、核心域和碱性氨基酸富集域，用ＰＣＲ定点突变法在ＨＩＶ－１Ｔａｔ蛋白的这些区域引入单氨基酸或多氨基酸突变；构建了以ＨＩＶ－１ＬＴＲ－１５８到＋８Ｏ区域为启动子，含有不同突变点的突变Ｔａｔ基因表达质粒；以荧光酶基因为报告基因，瞬时共转染Ｊｕｒｋａｔ细胞：分析不同氨基酸突变对Ｔａｔ的反式激活作用的影响。结果发现，突变后的Ｔａｔ蛋白的活性均极大地降低或丧失，表明这些序列内的氨基酸的确定性对Ｔａｔ的活性至关重要。

多聚TAR-CoreRNA诱饵对人免疫缺陷病毒1型Tat蛋白活性的抑制作用

为了抑制Ｔａｔ蛋白的反式激活作用，在细胞内大量表达外源ＴＡＲＲＮＡ使其与Ｔａｔ蛋白结合，从而竞争性抑制其与ＨＩＶ－１ＬＴＲ的ＴＡＲＲＮＡ元件结合．构建了以ＨＩＶ－１ＬＴＲＹＬ１５８（－１５８～＋１８０）为启动子，分别含有４，８和１５个拷贝的ＴＡＲ－ＣｏｒｅＲＮＡ诱饵（ｄｅｃｏｙ）表达质粒；以荧光酶基因为报告基因，检测了瞬时共转染体系中含不同拷贝数的ＴＡＲ－ＣｏｒｅＤＮＡ转录产物对Ｔａｔ蛋白反式激活作用的影响．结果证明，ＴＡＲ－ＣｏｒｅＲＮＡ诱饵对Ｔａｔ蛋白活性具有很强的抑制作用，其抑制程度与ＴＡＲ－ＣｏｒｅＤＮＡ串联体的拷贝数有关．

HL－60细胞诱导分化过程中蛋白质酪氨酸磷酸化水平的改变

对ＲＡ、ＨＨＴ和ＷＢ_（６５２）诱导ＨＬ－６０细胞过程中，细胞浆和膜溶脱部分的蛋白质酪氨酸磷酸化水平变化进行了对比研究，结果发现，在胞浆部分主要有四种含有Ｐ－Ｔｙｒ的蛋白，而且８０ｋＤ蛋白酪氨酸磷酸化水平随着诱导发生变化。诱导前后内源性蛋白上Ｐ－Ｔｙｒ百分含量也发生了改变。

反义多聚TAR对人免疫缺陷病毒Ⅰ型TAT蛋白活性的抑制作用

以HIV-1TAR(Trans-acting response element)的PCR引物为自身模板,用PCR法直接扩增得到多拷贝的TARDNA同向串连体;构建了以HIV-1LTR(-158～+80)片段为启动子,含有4,8和15个拷贝的TAR DNA反义表达质粒;以荧光素酶基因为报告基因,检测了瞬时共转染体系中不同拷贝数的反义TARDNA转录产物对Tat反式激活作用的抑制作用。结果表明,反义多聚TAR RNA对Tat活性具有很强的抑制作用,其抑制程度与反义TAR串联体的拷贝数有关。

反显性突变Tat蛋白抑制人免疫缺陷病毒1型的复制

Tat(Transactivator)蛋白是人免疫缺陷病毒HIV基因组编码的反式激活因子。为了进一步研究M5 Tat和M6 Tat蛋白对HIV病毒复制的抑制作用,将可被Tat调控的启动子YL158替换基因治疗中常用的逆转录病毒载体LNCX中的CMV启动子,构建了表达上述反显性Tat蛋白的逆转录病毒载体,随后导入双向性包装细胞PA317细胞中,用产生出的复制缺陷病毒感染MT4 T淋巴细胞.用HIV-1病毒攻击稳定表达有M5和M6 Tat蛋白的MT4细胞;结果显示,M5和M6 Tat蛋白均能抑制低剂量的HIV-1病毒的复制。

Tat和TAR对人免疫缺陷病毒HIV-1基因表达的调控研究

目的为了寻找能够阻断HIV-1复制的方法,探索控制HIV-1蔓延的第二代基因治疗的新途径。方法采用自身引物一模板PCR得到了含有TAR核心序列(+11到+47)的多聚TAR-Core DNA同向串联体。结果所有这些抗性基因策略均能对病毒的复制产生较好的抑制作用。结论 TAT蛋白序列中氨基酸的替换使活性改变,与其三维结构的变化间有一定的相关性。

利用PCR构建多拷贝HIV-1 TAR序列的串联体

建立“自身引物—模板”PCR方法 ,并应用此方法成功地扩增了多拷贝HIV 1TAR片段的同向串联体。此方法简便 ,省力 ,可用于多拷贝基因探针、多拷贝反义基因片段、多拷贝抗原表位的扩增和克隆。

红细胞分化因子诱导HL-60细胞排核过程中酪氨酸蛋白质磷酸化的改变

红细胞分化因子是从兔子网织红细胞中提出的一个蛋白因子，它可以使多种癌细胞株的生长受到抑制[1]．以早幼粒白血病细胞（HL-60）为材料，研究其被EDDF诱导过程中细胞内PTK，PTPP及它们底物磷酸化水平的变化．实验发现：部分纯化的EDDF对HL-60细胞生长有明显的抑制作用，经NBT还原和Giemsa染色，可见HL-60细胞被诱导出现排核．同时，细胞的PTK，PTPP酶活性有明显的变化，PTPP和PTK的底物蛋白在胞浆中酪氨酸蛋白磷酸化水平亦出现改变（但颗粒部分变化不明显）．

蛋白质磷酸化和脱磷酸化对DNA拓扑异构酶Ⅰ活力调节的研究

本文以小鼠正常肝和H_(22a)腹水型肝癌细胞为材料,从中分离出纯度较高的拓扑异构酶Ⅰ和细胞质酪氨酸蛋白激酶(TPK)来研究磷酸化和脱磷酸化对拓扑异构酶Ⅰ活力的调节。结果表明TPK能活化拓扑异构酶Ⅰ。另外还发现PKA和碱性磷酸酶(CIP)能分别活化和抑制拓扑异构酶Ⅰ。

抗肿瘤药物对细胞核TPK活力的影响

本文测定了几种抗肿瘤药物对小鼠正常肝细胞和Ｈ２２腹水肝癌细胞核酪氨酸蛋白激酸（ＴＰＫ）活力的影响，其中盐酸氮芥、氟尿嘧啶、猪苓多糖、环磷酰胺、去甲斑茅素、三尖杉酯碱和油酸多相脂质体７种药物表现出对Ｈ２２腹水肝癌细胞ＴＰＫ活力明显的选择性抑制作用，而对正常肝细胞ＴＰＫ作用不明显。

INTRACELLULAR EXPRESSION OF MULTIMERIZED ANTISENSE TAR-CORE RNAS INHIBIT THE REPLICATION OF HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS TYPE 1 IN HUMAN CD_4+T LYMPHOCYTES

ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮＩｔｉｓｒｅｐｏｒｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅａｒｅｍｏｒｅｔｈａｎ２８ｍｉｌｉｏｎＨＩＶ－ｉｎｆｅｃｔｅｄｐｅｏｐｌｅｎｏｗｉｎｔｈｅｗｏｒｌｄ．Ｂｕｔｕｎｆｏｒｔｕ－ｎａｔｅｌｙ，ａｎｔｉ－ＨＩＶｔｈｅｒａｐｙｉｓｓｔｉｌｆａ...

HIV感染的基因治疗研究进展

由于目前尚无有效的抗HIV感染的化学药物和疫苗,从九十年代开始,人们开始日益重视探索HIV感染的基因治疗的新途径。HIV感染的基因治疗就是把具有治疗作用的基因转移到合适的靶细胞中,使其在表达为RNA或蛋白质后干扰HIV基因表达及调控,以达到防治HIV感染的目的。HIV的分子生物学研究的深人和体细胞基因治疗技术的发展为HIV感染的基因治疗提供了基础。目前采用的策略主要有三大类:抗病毒的基因治疗;细胞毒性基因治疗和兔疫调节基因治疗。其中已有一些临床实验方案付诸实施。

HIV-1 Tat蛋白定点突变的分子动力学模拟

HIV 1Tat的Cys富集区、核心区和碱性氨基酸富集区是高度保守的 ,并且对于Tat反式激活作用至关重要 .用分子动力学模拟的方法构建了HIV 1Tat蛋白在上述 3个区域进行定点突变的 6种突变体的三维结构 ,分析了突变体的结构变化 。