基因C型鸭甲肝病毒VP1基因的克隆及原核表达

为原核表达基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)VP1重组蛋白,本研究通过设计套式PCR引物,RT-PCR扩增DHAV-C VP1全基因,约为720 bp,将其亚克隆至pET-32a(+)载体中构建重组表达质粒pET-VP1。将其转化E.coli Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导表达了约47 ku的重组蛋白。Western blot分析表明,该重组蛋白可以与兔抗DHAV-C阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。

对鸡卵黄免疫球蛋白两种提取方法的比较

本文比较了水稀释-饱和硫酸铵沉淀法(法一)和水稀释-冰乙醇分级沉淀法(法二)分离提纯鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)的产率、纯度及抗体效价。结果表明:两种方法提取的IgY纯度均较高,法一纯化的IgY的产率及蛋白活性相对更好。

以公共科研平台及临床学科研究室建设促进医院学科发展

建立公平可及、高效可靠的公共科研平台,以临床学科或亚专业为导向建设归属临床科室的临床学科研究室,是满足医院不同层次实验需求、有效促进基础研究与临床学科真正结合的关键。以四川大学华西医院为例,介绍了建立不同类型的公共平台,建设归属临床科室的临床学科研究室,培养高素质技术人员,再借助公共平台的技术支持推动临床学科发展的模式。

禽传染性喉气管炎病毒体内外感染模型中鸡Toll样受体21 mRNA转录水平的研究

为研究病毒与机体的相互作用,本研究参考GenBank中鸡Toll样受体21(ChTLR21)的基因序列设计实时定量PCR特异性引物,以鸡核糖体蛋白L4(RPL4)为内参基因,建立检测ChTLR21 mRNA相对转录水平的实时定量PCR方法,分析ChTLR21在禽传染性喉气管炎病毒(ILTV)感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)中和感染SPF雏鸡免疫器官脾脏、法氏囊和胸腺组织中的转录水平。结果显示:ILTV感染CEF后2 h、4 h、8 h和18 h时间点ChTLR21 mRNA转录水平分别为未感染对照细胞的1 540.53、0.98、1.19和3.70倍。但仅在ILTV感染2 h时引起ChTLR21转录水平升高,与对照组相比差异显著(p<0.05)。ILTV感染SPF雏鸡后6 h、24 h和30 h脾脏中ChTLR21 mRNA转录水平分别为未感染对照的56.34、59.85和3.61倍;法氏囊中分别为0.03、25.98和3.08倍;胸腺中分别为2.52、50和7.32倍。在感染初期,脾脏中ChTLR21转录量显著升高,随后有所降低,但均高于未感染对照(p<0.05);法氏囊中仅在感染6 h时呈显著抑制(p<0.01);胸腺中呈波动性转录水平升高,但与对照组无统计学差异(p>0.05)。本研究证明ChTLR21参与了鸡体对ILTV感染的应答,并在体内外感染模型中呈现不同的表达规律。

基因C型鸭甲肝病毒实验感染雏鸭的组织病理学及病毒分布

旨在研究基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)感染导致雏鸭的组织病理学变化和病毒的组织分布,为该病毒的致病机理研究奠定基础。本研究以基因C型鸭甲肝病毒感染SPF雏鸭,感染后不同时间点采取雏鸭10个不同组织器官制备组织切片,通过HE染色和免疫酶组织化学染色对感染雏鸭的组织病理学变化及病毒抗原免疫组化定位进行观察。结果表明:DHAV-C感染导致雏鸭的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、胸腺、胰脏、大脑和法氏囊共10个组织器官均发生了不同程度的病变,同时在这些器官中均有病毒抗原检出,在10个检测组织器官中,以肝脏、脾脏、肾脏、法氏囊、胸腺和胰脏等器官的组织病变和抗原检出最为明显,病变的严重程度与病毒抗原检出量成正相关。DHAV-C广泛分布到受检组织器官中,它导致的组织病理学变化严重程度与病毒抗原的检出量成正相关,推测DHAV-C入侵导致肝、肾和免疫器官的损害,是其急性感染发病的根本原因。

14株基因C型鸭甲肝病毒分离株的VP1基因变异及其编码蛋白的抗原表位分析

对14株分离自四川不同地区的基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)VP1基因进行了PCR扩增、测序、序列比对分析以及抗原表位分析。结果显示,14株DHAV-C VP1基因核苷酸序列的同源性为92.2%～100%,推导氨基酸序列的同源性为85.8%～100%,与GenBank中的24株DHAV-C VP1基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为87.9%～99.3%和80.8%～100%。聚类分析显示,四川华阳地区分离的6株DHAV-C的VP1基因与黑龙江分离株Du/CH/LJS/090905同属一支,3株四川邛崃地区分离株与北京分离株C-GY及福建分离株FJ01同属一支,4株四川郫县分离株与1株四川邛崃分离株处于独立的小分支,它们与其他毒株之间存在一定的遗传距离。DHAV-C VP1蛋白由240个氨基酸组成,是由α螺旋、β折叠和无规则卷曲共同组成的混合型蛋白,VP1蛋白氨基酸序列的亲水性、抗原指数和表面可及性均较高,其中212～222位氨基酸区域的亲水性、抗原指数和表面可及性最高,可能是DHAV-C VP1蛋白上的B细胞表位优势区域,为DHAV-C表位疫苗的研究提供了理论依据。结果表明,四川分离株可能由于引种等原因从全国不同地区进入四川境内。

人胎盘蜕膜基层来源MSCs参与裸鼠皮肤创面修复的研究

目的探讨人胎盘蜕膜基层来源MSCs（placental decidua basalis derived MSCs, PDB-MSCs）参与裸鼠全层皮肤缺损修复的效果。方法取自愿捐赠人胎盘组织，采用酶消化法结合密度梯度离心法分离培养PDB—MSCs并传代，取第4代细胞进行实验。倒置相差显微镜观察细胞形态，行成骨与成脂诱导鉴定，检测细胞表面特异性抗原表达以鉴定细胞。取42只4—5周龄雌性BALB／c裸鼠，随机分为两组（n=21）；分别将200gL浓度为5〉（106个／mL的第4代PDB—MSCs及等体积PBS经尾静脉注射入实验组及对照组裸鼠体内；注射后3d实验动物于背部制备大小为1．5cmxl．5cm全层皮肤缺损模型。术后1、2、4、7、14、18、21、25、30d大体观察创面愈合情况，待创面开始脱痂后测量创面愈合率。术后1、7、14、21、30d取材行HE染色，观察创面修复情况；7、14、30d实验组采用免疫荧光染色法行细胞定位分析。结果经鉴定胎盘蜕膜组织所分离的细胞为MSCs，具有多向分化能力和MSCs免疫组织表型。术后两组裸鼠存活至实验完成。大体观察示，实验组创面愈合较对照组快，其中实验组于术后12—14d、对照组于14—17d开始脱痂。实验组术后14、18、21d创面愈合率均显著高于对照组（t=4．001，P=0．016；t=3．380，P=0．028；t=3．888，P=0．018）；25、30d两组比较差异无统计学意义（t=1．565，P=0．193；t=1．000，P=0．423）。组织学观察示，与对照组比较，实验组皮肤创面组织炎性反应低，并且随时间延长皮肤各层组织及腺体等再生良好。免疫荧光染色示，术后各时间点实验组皮肤创面区域均可见人线粒体抗原染色阳性，提示存在人源细胞。结论通过酶消化法结合密度梯度离心法可稳定获得PDB．MSCs，预先注射人裸鼠体内后，在皮肤损伤条件下细胞可向皮肤损伤部位迁移，并促进创面修复。