紫花苜蓿PGIP同源基因克隆与序列核苷酸多态性分析

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是植物重要的防卫蛋白之一,了解PGIP基因的核苷酸序列是对其进行分子遗传学与分子生物学研究的前提与基础。本研究采用同源克隆法,从16个紫花苜蓿(Medicago sativa)品种的集群DNA中克隆了7个苜蓿PGIP基因的部分基因组编码序列,分别对应于蒺藜苜蓿(M.truncatula)7个不同的PGIP基因,并命名为Ms PGIP5、Ms PGIP6、Ms PGIP7、Ms PGIP8、Ms PGIP9、Ms PGIP10和Ms PGIP11。其中,Ms PGIP5、Ms PGIP6、Ms PGIP8、Ms PGIP9和Ms PGIP11的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)位点间的平均距离分别为20、74、34、423和21 bp,差异较大。对Ms PGIP5、Ms PGIP6、Ms PGIP8和Ms PGIP11进行荧光标记PCR单链构象多态性(FPCR-SSCP)分析,结果表明,其等位基因数目与PCR片段长度的比值分别为20、56、22和19 bp,变化趋势与这4个基因SNP位点间的平均距离基本一致。比较而言,在发现的7个苜蓿PGIP基因中,Ms PGIP9序列高度保守,Ms PGIP5和Ms PGIP11的变异较大,而Ms PGIP6与Ms PGIP8的变异中等。

苜蓿多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白2(MsPGIP2)基因多态性分析

本研究旨在分离苜蓿多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白2(MsPGIP2)基因的基因组序列全长,分析序列变异。首先采用引物热不对称PCR的基因组DNA步移法分离其基因组序列全长,然后通过克隆测序分析了MsPGIP2基因在3个苜蓿品种(‘润布勒’、‘苏普斯坦’与‘公农1号’)中的多态性。结果显示,MsPGIP2基因的基因组DNA序列全长1 126bp,可分为信号肽、内含子和LRR区3部分。MsPGIP2基因的基因组序列中共有46个变异位点(频率>0.02)。在信号肽区,没有变异位点;在内含子区,有5个SNP位点和2个InDel变异位点;而在LRR区,共发现了39个SNP位点,其中非同义突变占61.5%。在3个苜蓿品种中共发现了15个等位基因(即单倍型),通过对LRR区核苷酸的系统发育分析将他们分成3类。结论认为,MsPGIP2基因具有较大的变异,各等位基因间发生了频繁的重组交换,是一个为适应病原微生物PG的进化而快速进化的基因。