大豆主要过敏原β-伴大豆球蛋白β亚基的抗原表位分析及分段克隆

利用生物信息学软件SWISS-MODEL对大豆主要过敏原β-伴大豆球蛋白β亚基建立出三级结构模型,并根据Disco Tope 2.0服务器预测出该模型的构象表位相关区段,采用分段克隆方式扩增目的基因的3个片段区域,利用PCR技术扩增目的基因全长及3个互相重叠的片段(A、B、C)将其连接至p MD18-T载体,并转化到大肠杆菌感受态JM109。经蓝白斑筛选,以及对重组质粒进行PCR和双酶切验证,测序结果与设计的基因序列一致,成功得到了目的基因片段的阳性克隆子,为β-伴大豆球蛋白β亚基分段表达及抗原区域位置的筛选与鉴定提供参考。

β-伴大豆球蛋白多克隆抗体的制备及纯化前后免疫学特性鉴定

以β-伴大豆球蛋白免疫新西兰兔,制备抗β-伴大豆球蛋白多克隆抗体。利用正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化多抗血清,并分析纯化前后多抗血清蛋白含量、纯度、效价、敏感性及特异性。结果表明,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯化后血清纯度得到提高;间接ELISA法检测多抗血清效价及敏感性无明显变化;与大豆Gly m Bd 28K蛋白和花生蛋白的交叉反应率分别由25.28%、1.16%降至为0.79%、0.2%。制得的抗β-伴大豆球蛋白多克隆抗体特异性高。为β-伴大豆球蛋白致敏蛋白的检测,和大豆β-伴大豆球蛋白致敏亚分子结构的定位奠定了基础。

禽蛋中氟苯尼考代谢物快速检测方法的建立

基于免疫层析技术建立禽蛋中氟苯尼考残留标志物(氟苯尼考与氟苯尼考胺之和)的快速检测方法。采用乙酸乙酯对禽蛋中氟苯尼考及其主要代谢物氟苯尼考胺进行提取,并用二氯乙酸酐将提取液中的氟苯尼考胺衍生化为氟苯尼考,最后用氟苯尼考胶体金检测卡进行检测。结果表明,氟苯尼考胺在乙酸乙酯体系中成功衍生化为氟苯尼考,氟苯尼考及氟苯尼考胺检出限分别为1、3μg/kg。另外,通过对实际阳性鸡蛋样品及加标样品进行检测,其结果与国标方法测量结果基本一致。本方法具有简便、快速、低成本等特点,适合大批量样品的现场筛查,提高监管效率。

高静压在脱敏食品中的应用研究

高静压可以改变食物的结构和功能特性,掩盖食物过敏原的抗原表位,从而降低食物的过敏原性,被广泛应用于脱敏食品的加工过程中。阐述了食品脱敏的必要性,介绍了食品过敏原种类、作用机理及发病机理,综述了近几年高静压在食品脱敏中的应用。

免疫亲和层析柱纯化大豆球蛋白多克隆抗体的研究

为了得到纯度高、特异性好的抗大豆球蛋白多克隆抗体,用溴化氢活化的琼脂糖4B纯化经硫酸铵分级沉淀后的抗体,此免疫亲和层析过程节省时间且操作简单。经凝胶过滤层析的大豆球蛋白,溶胀后的填料与大豆球蛋白配基以共价键的形式连接,利用抗原抗体特异性结合的特点,杂蛋白随流动相流出,再利用洗脱液将抗大豆球蛋白的目标抗体特异性地洗脱下来,用紫外检测仪检测非特异性洗脱峰和特异性洗脱峰。通过SDS-PAGE鉴定,多抗血清中的其它蛋白组分被非特异性洗脱掉,经浓度测定,特异性洗脱的蛋白质量浓度为0.3 mg/mL,间接ELISA显示,纯化后血清稀释128倍后显示为阳性。间接竞争ELISA测定抗体特异性结果显示抗体特异性得到提高。抗体被成功纯化,为加工破坏大豆球蛋白致敏性亚分子结构定位奠定基础,从而促进低致敏性食品的研发。

响应面法优化β-伴大豆球蛋白超高静压处理条件的研究

β-伴大豆球蛋白是7S球蛋白的主要成分,是重要的大豆抗原蛋白。在单因素试验的基础上对超高静压处理压强、处理时间、β-伴大豆球蛋白质量浓度3个因素进行研究,以β-伴大豆球蛋白抗原抑制率为响应值,采用响应面法优化β-伴大豆球蛋白超高静压处理条件。结果表明:β-伴大豆球蛋白超高静压处理最佳条件为压强455 MPa、时间18 min、蛋白质量浓度15 mg/m L,在此条件下β-伴大豆球蛋白抗原性抑制率为49.59%。验证试验测得此条件下β-伴大豆球蛋白抗原抑制率为51.19%,标准偏差为1.07%,说明利用响应面法分析结果可靠。

表面增强拉曼光谱法定性定量检测保健食品中非法添加物西地那非

建立表面增强拉曼光谱法定性定量检测保健食品中非法添加药物西地那非。利用拉曼光谱的特异性进行西地那非定性检测;用三聚氰胺作为内标物进行西地那非定量检测,以西地那非特征峰1234 cm-1与三聚氰胺特征峰707 cm-1的峰高比为纵坐标,西地那非质量浓度为横坐标进行线性回归拟合,结果表明西地那非质量浓度在0~50 mg/L范围呈现良好的线性关系,R2=0.9969。定性检测限为0.05 mg/L,定量检测限为5 mg/L。其固体、液体样品加标回收率分别为85.6%~92.6%、98.7%~105.2%,相对标准偏差分别为4.14%、3.25%。采用本方法对实际样品进行检测,其结果与高效液相色谱-质谱法测量结果基本一致。本方法准确、灵敏、快速,可用于保健品中非法添加西地那非类药物的定性定量检测。

表面增强拉曼光谱技术在快速检测保健食品中非法添加药物中的应用

表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)技术作为一种新型的快速检测技术正在被广泛应用于保健食品非法添加化学药物的检测中。通过设计不同的SERS基底,可以搭建出集样品前处理、上机分析、匹配定性的一体化拉曼光谱检测系统。与传统的检测方式相比,SERS技术具有无损、快速、图谱指纹特性强等优点,在保健食品非法添加化学药物的快速检测中具有巨大潜力。本文主要综述了SERS的技术原理、SERS基底分类以及SERS技术在保健食品中非法添加化学药物检测中的应用,并对SERS技术在保健食品中非法添加化学药物检测方面的应用前景进行了展望,以期为保健食品中未知违禁物的识别提供理论支撑。

蔬菜水果中菊酯类农药残留快速检测的方法研究

为研究一种蔬菜水果中菊酯类农药残留快速检测方法,通过选购市场上常见的胶体金免疫层析产品及菊酯类农药,对蔬菜水果中菊酯农残的快速检测进行前处理步骤的优化,并考察每种胶体金免疫层析产品在果蔬基质样品检测中的灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率和准确度,以实现胶体金免疫层析产品的整体性评价。结果表明,直接稀释法检测大白菜、韭菜和柑橘时,检测限较高,无法满足检测要求;直接提取法适用于大白菜、韭菜和柑橘的快速检测,检测限为2 mg/kg。方法学验证结果表明:以大白菜、韭菜和柑橘作为空白基质的检测限为2 mg/kg,灵敏度均为100%,特异性为100%,假阳性率为0,假阴性率为0。该方法快速准确、灵敏度高,可适用于蔬菜水果中菊酯类农药残留的快速检测。

基于ICP-MS截尾数据与支持向量机优化模型鉴别蜂蜜植物源

该文开展了一种电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)截尾数据和支持向量机(SVM)分类模型识别蜂蜜植物源的研究。实验选取荆条蜜、洋槐蜜、葵花蜜、油菜蜜4种不同植物源的蜂蜜共97例,经微波消解等预处理后,采用ICP-MS分别测得蜂蜜样品中16种金属元素的含量,并研究13种具有显著性差异的金属元素,以含截尾数据和不含截尾数据的元素作为输入变量分别建立基于高斯径向基函数的SVM分类模型,并通过网格搜索法(GS)、遗传算法(GA)、粒子群优化(PSO)算法对SVM模型中的惩罚参数c和核函数参数g进行优化。结果表明:Al、Ti、Cr、Ni、As、Se、Cd、Ba、Pb 9种金属元素存在截尾数据;方差分析结果表明,4种不同植物源蜂蜜之间,Na、Mg、Al、K、Ca、Mn、Ni、Cu、Zn、Se、Ba、Pb 12种金属元素在95%置信区间差异极显著,As元素在95%置信区间差异显著,Ti、Cr和Cd在95%置信区间无显著性差异,使用替换法将截尾数据按二分之一检出限值处理并作为输入变量时所建立的SVM模型分类效果更优;使用截尾数据所建立模型的判别正确率为91.8%,而不含截尾数据建立模型的判别正确率仅为82.5%。使用网格搜索法、遗传算法、粒子群优化算法对分类模型中惩罚参数c和核函数参数g作进一步优化,通过PSO算法寻优获得惩罚参数c为62.8,核函数参数g为1.26的条件下所建立的分类模型最优,其综合判别正确率为96.9%。由此可见,利用替换法按二分之一检出限值处理截尾数据作蜂蜜植物源鉴别分析是可行的,同时表明基于ICP-MS截尾数据结合SVM优化模型能提高模型判别正确率并可有效鉴别不同植物源蜂蜜。

表面增强拉曼光谱法测定保健食品中非法添加物硝苯地平

建立表面增强拉曼光谱法定性定量检测保健食品中非法添加物硝苯地平。采用柠檬酸三钠法制备胶体金,探索最优金胶浓度及粒径范围,确定以100 mL纯水中加入3 mL 1%氯金酸溶液及2.7 mL 1%柠檬酸三钠制备的金胶具备良好的信号增强效果,经粒径仪结果显示金溶胶粒在85 nm左右。利用拉曼光谱的特异性进行硝苯地平定性检测,结果发现部分降血压药物在(1334±3)cm^(-1)和(1642±3)cm^(-1)处有明显特征峰,用三聚氰胺作为内标物进行硝苯地平定量检测,以硝苯地平特征峰1334 cm^(-1)与三聚氰胺特征峰707 cm^(-1)的峰高比为纵坐标,硝苯地平浓度为横坐标进行线性拟合,结果发现硝苯地平质量浓度在0~100 mg/L有良好线性关系,相关系数为R^(2)=0.9957,定性检测线为5 mg/L,其固体、液体样品加标回收率分别为88.8%~96.5%和90.2%~96.6%,标准偏差分别为4.17%和3.49%。试验方法准确、灵敏、快速,可用于保健品中非法添加硝苯地平药物的定性定量检测。

食品中米酵菌酸快速检测方法的研究和建立

建立基于免疫层析技术的食品中米酵菌酸的快速检测方法。对银耳、河粉及玉米粉等代表性基质样品采用胶体金免疫层析法进行检测。优化了快速检测的前处理流程,并考察了胶体金免疫层析商品化产品在典型基质中的检出限、灵敏度、假阳性率、假阴性率、交叉反应率、温度耐变性、抗基质干扰能力、准确度和重复性等指标。结果表明,优化后的前处理条件使该方法检出限达到15μg/kg,灵敏度为100%,假阳性率和假阴性率均为0,脂肪酸类结构类似物和真菌毒素类物质交叉反应率为0。同时,该方法对检测环境温度不敏感且抗食品基质干扰能力强。另外,该方法具有较高准确度且重复性良好,与参比方法结果具有一致性。该方法易操作、用时少、准确性高,检出限低,适合批量样品的现场快速筛查。

大豆主要过敏原Gly m Bd 28K的同源建模和B细胞表位的预测

利用生物信息学软件SWISS-MODEL和Deep View 4.1对Gly m Bd 28K进行同源建模并对做出的模型进行评估。利用DNAStar和SOPMA分析Gly m Bd 28K的亲水性、柔韧性、表面可及性、抗原指数和二级结构,预测出Gly m Bd 28K的4个B细胞线性表位5-13,75-77,175-177,200-203。根据三级结构模型,通过Disco Tope 2.0预测出Gly m Bd 28K的6个与构象表位相关的区段11-14,40-41,43,114-115,185-192,194-207。

大豆致敏原β-伴大豆球蛋白α’亚基的分段与克隆鉴定

大豆是引起人们食物过敏的八大过敏原之一,β-伴大豆球蛋白是大豆主要致敏蛋白之一,并且3个亚基α、α’、β都具有致敏性。利用生物信息学软件对β-伴大豆球蛋白α’亚基进行Overlapping(重叠)分段,通过PCR技术扩增到目的片段,与pMD 18-T载体连接;对重组质粒进行PCR和双酶切鉴定,鉴定结果与基因序列一致,成功构建克隆载体。

β-伴大豆球蛋白的分离纯化及免疫活性鉴定

β-伴大豆球蛋白是7S球蛋白的主要成分,是重要的大豆贮藏蛋白。利用等电点沉淀、分级盐析和凝胶过滤分离纯化大豆中的β-伴大豆球蛋白。SDS-PAGE和免疫印迹的结果表明,所提取的β-伴大豆球蛋白纯度较高,可以与β-伴大豆球蛋白抗血清特异性结合,具有较好的免疫活性。

大豆主要过敏原β-伴大豆球蛋白α亚基的分段及克隆载体的构建

利用生物信息学软件将大豆主要过敏原β-伴大豆球蛋白α亚基分为相互重叠的4个片段(A、B、C、D),设计和合成系列引物。利用PCR技术分别扩增β-伴大豆球蛋白α亚基Overlapping分段基因,将其插入到p MD-18T vector中,对重组质粒进行PCR和双酶切鉴定,测序结果与设计基因序列一致,成功构建了克隆载体。为研究β-伴大豆球蛋白α亚基的分段表达及抗原表位的筛选提供参考。