大型医院综合科研实验室人员生物安全教学的实践与体会

目前，国内大型医院特别是各医科大学教学医院，纷纷建立自己的中心实验室，为医学科研和研究生培养提供场所，保证大型仪器和专职科研人员等资源的集约式使用，易于形成良好的学术交流氛围，有益于科研产出。但大型实验室由于人员流动性大，所涉及试剂、动物和各种生物标本种类繁多，容易造成各类安全特别是生物安全事件。实验室生物安全是指为避免微生物和医学实验室各种活动中生物因子对人、环境和社会造成的危害或潜在危害，而采取的防护措施、人员培训及管理措施，以达到对人、环境和社会的安全防护目的的一种综合行为。但目前，在国内进行系统生物安全教学的实验室非常有限，近期，本实验室将实验室生物安全教育作为研究生入室后的培训课程，对研究生们的生物安全和自身防护意识的培养起到了很好效果，现将本实验室的教学实践和体会总结如下。

人源性exCAR蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定

目的在大肠杆菌中表达人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区蛋白(exCAR),纯化表达蛋白并进行Western-blot-ting鉴定。方法从Hela细胞株中扩增exCAR基因片段,连接至表达质粒pET-28a(+)构建为重组质粒pET-28a-exCAR,转化至大肠杆菌BL21株中,筛选高表达株,诱导表达,利用Ni+株亲和纯化表达蛋白,SDS-PAGE后,转印PVDF膜后,进行Western-blotting鉴定。结果获得纯化的大肠杆菌表达蛋白exCAR,表达形式为包涵体,经Western-blotting鉴定为人源性exCAR蛋白。结论本研究获得了纯化的exCAR表达蛋白,为下一步的蛋白复性和腺病毒感染的阻断实验提供了基础。

人源性exCAR原核表达蛋白体外阻断腺病毒感染实验研究

目的在培养乳鼠心肌细胞上检测人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区(exCAR)大肠杆菌原核表达蛋白阻断腺病毒感染的活性。方法纯化人源性exCAR表达蛋白并通过透析复性,进一步体外实验,在腺病毒感染乳鼠心肌细胞模型上检测表达蛋白阻断腺病毒感染效率。结果获得纯化表达蛋白exCAR,经复性后,在体外实验中检测到其阻断腺病毒感染心肌细胞效应,其终浓度为500ng/mL时,获得最高阻断效率约75%。结论本研究获得了具有生物活性的exCAR表达蛋白,为腺病毒感染防治提供了新的思路和基础。

采用Red重组系统敲除铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因

目的敲除铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,获得无弹性蛋白酶活性的铜绿假单胞菌菌株。方法采用PCR从pKD46质粒上扩增λ噬菌体的Red重组酶基因,并将其克隆到大肠杆菌和铜绿假单胞菌穿梭质粒pUCP多克隆位点上,电击转化铜绿假单胞菌PAO1感受态细胞,构建PAO1/pUCP-Red基因敲除体系。常规基因操作构建两端与弹性蛋白酶基因上、下游同源,中间为庆大霉素抗性基因的线性打靶片段;并将其电击转化pUCP-Red/PAO1感受态;采用庆大霉素和羧苄青霉素抗性平板初步筛选阳性重组菌;通过PCR、RT-PCR及弹性蛋白酶活性检测方法,鉴定菌株弹性蛋白酶基因的敲除情况。结果本研究通过构建Red重组系统,获得了无弹性蛋白酶活性的铜绿假单胞菌菌株。结论本研究成功敲除了铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,所获无弹性蛋白酶活性的菌株将为系统深入研究弹性蛋白酶在铜绿假单胞菌致病性中的详细作用机理提供材料和基础。

铜绿假单胞菌中群体感应系统的研究进展

群体感应系统(quorum sensing)是一种细菌细胞与细胞间的信号传递系统。细菌通过可扩散的小分子信号分子感知细胞群体的密度,从而引起一些特定基因在细菌群体中的协调表达。铜绿假单胞菌中的QS系统包括LasI/LasR和RhlI/RhlR两条主要的信号系统和喹诺酮信号系统。本文系统地介绍了铜绿假单胞菌中QS系统的研究现状和相关应用。

FMEA在科研实验室危险化学品管理中的应用

目的探讨失效模式与效应分析(FMEA)在科研实验室危险化学品管理中的应用效果.方法运用FMEA梳理科研实验室危险化学品管理流程,确立主题,组建团队,进行失效模式和潜在因素分析,计算事先风险指数(RPN)值,根据分析结果制定有效防范措施并实施.结果科研实验室危险化学品管理潜在失效模式风险系数RPN值大幅度下降,危险化学品安全管理平均合格率由48.33%上升至95.50%,具有统计学差异(P<0.01).结论 FMEA可有效降低科研实验室危险化学品管理风险,提高医院科研人员危险化学品管理风险意识.

PA1864基因敲除对铜绿假单胞菌毒力及致病性的影响

目的评价PA1864基因在铜绿假单胞菌(PA)毒力及致病性中的作用。方法比较野生菌株(PAO1与PA1864基因敲除菌株(△PA1864)急性感染小鼠肺或A549肺癌细胞后细菌毒力表型及致病性的差异,包括小鼠的生存率、肺水肿、组织损伤,细胞活力,PAO1和△PA1864菌株分泌性毒力因子、Ⅲ型毒力蛋白分泌系统(T3SS)及群体感应(QS)系统表达情况等。结果 PA1864基因敲除后,菌体对宿主的致病性及细胞毒性降低,细菌泳动能力、T3SS相关蛋白(ExoS、PcrV)表达下调,而绿脓素合成量增加,喹诺酮QS系统信号分子合成增加。结论 PA1864基因可促进PA毒力,且该调节作用可能与喹诺酮QS系统有关。

打造特色技术平台，加快研究生科研产出——医院中心实验室通用技术平台建设的体会

大型医院中心实验室是我国培养医学相关专业研究生的重要基地，技术平台的建设是保障实验室高效运行的基础。本文结合本单位实际，在充分调研医学科学学位研究生关于医学实验技术需求的基础上，就如何建立和完善具有一定特色的通用医学实验技术平台，加快研究生科研产出进行分析和讨论。