维氏气单胞菌脂蛋白Lpp/LppB双基因缺失株的构建与验证

在维氏气单胞菌单基因缺失株ΔLpp的基础上,通过同源重组方法获得脂蛋白LppB基因上、下游同源臂连接片段,依次构建重组克隆载体pMD18-T-L-UD1225和重组自杀性载体Pre112-L-UD1225,随后转入WM3064感受态细胞中作为供体菌,与受体菌ΔLpp进行结合转移,构建双基因缺失株ΔLpp/LppB,通过反转录验证并检测其遗传稳定性。结果显示,成功构建了遗传稳定性良好的双基因缺失株ΔLpp/LppB,其生长速率和生物被膜形成能力较野生株WT均下降。结果表明,协同缺失脂蛋白基因Lpp和LppB后,双基因缺失株ΔLpp/LppB的生长和生物被膜变化更显著,这有利于进一步推测脂蛋白基因的功能,为之后研究维氏气单胞菌的致病机制奠定了基础。

维氏气单胞菌脂蛋白Lpp基因缺失株的构建及其部分生物学特性分析

为了探究维氏气单胞菌毒力因子脂蛋白的致病机制,在全基因测序的基础上,通过同源重组缺失脂蛋白基因。首先扩增脂蛋白基因的上下游同源臂,通过重叠PCR连接后,凝胶回收DNA片段;连接克隆载体pMD18-T,转化DH5α感受态细胞,测序成功后提取质粒进行双酶切,连入相同酶切的Pre112自杀性质粒;依次转化DH5α-λpir、WM3064感受态细胞,作为供体菌;和受体菌野生株进行同源重组,并筛选鉴定。结果显示,成功缺失了维氏气单胞菌脂蛋白基因。生物学特性分析结果发现,缺失株和野生株的生长速度相似,生物膜形成能力降低,鞭毛缺失,游动能力减弱,细菌的毒力降低,溶血活性没有明显变化。因此,成功构建了维氏气单胞菌脂蛋白基因缺失株,并分析了其部分生物学特性,为进一步研究脂蛋白基因的功能奠定了一定的基础。

维氏气单胞菌脂蛋白的原核表达及其抗血清的抗菌作用研究

为了探究维氏气单胞菌毒力因子脂蛋白的生物学功能,对脂蛋白基因进行原核表达,对表达产物进行鉴定并制备多克隆抗体研究其抗菌效应。通过PCR扩增脂蛋白基因,连接至pET-32a(+)载体,构建重组质粒pET-32a(+)-Lpp。将重组质粒pET-32a(+)-Lpp转化入感受态细胞BL21(DE3),用IPTG诱导表达。利用His标签镍离子蛋白纯化柱对表达产物进行纯化,并采用SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组蛋白的表达产物。用纯化后的重组脂蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,多抗经皮下接种小鼠研究其抗菌效应。结果显示,经酶切鉴定和序列测定发现重组质粒pET-32a(+)-Lpp构建成功。通过SDS-PAGE检测发现,重组蛋白LPP在原核表达系统中以可溶性形式表达,分子质量约为69 ku。Western-blot结果显示,纯化后的重组蛋白LPP为单一条带。制备的多克隆抗体的效价为102 400,该多抗可提高荷菌小鼠的生存率,减少脾荷菌量。因此,本实验成功构建了重组质粒pET-32a(+)-Lpp,表达并纯化了重组蛋白LPP,制备的多抗具有抗菌作用,为该蛋白生物学功能的研究及疫苗的制备奠定了基础。