【目的】建立一种识别、检测致敏蛋白的新方法。【方法】Pen a 1为虾中主要的致敏蛋白,从其5个主要IgE结合区中选择一段具有代表性的(85—105位)含21个氨基酸的多肽序列,进行化学合成,将多肽分别与匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA...【目的】建立一种识别、检测致敏蛋白的新方法。【方法】Pen a 1为虾中主要的致敏蛋白,从其5个主要IgE结合区中选择一段具有代表性的(85—105位)含21个氨基酸的多肽序列,进行化学合成,将多肽分别与匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)偶联,制得免疫原和包被原,免疫原免疫新西兰纯种白兔得到多克隆抗体。以刀额新对虾蛋白、卵清蛋白、花生蛋白和牛奶蛋白为样品,免疫印迹鉴定多克隆抗体对刀额新对虾中Pen a 1蛋白的特异性。【结果】经Ellman试剂测定多肽与KLH、BSA的偶联比分别为12﹕1和8﹕1。间接非竞争ELISA测定多克隆抗体的效价达1.024×106,间接竞争ELISA(icELISA)测定该多克隆抗体对多肽的IC50和IC10分别为0.4324μg.mL-1和0.0004μg.mL-1,表明多克隆抗体对多肽具有较强的灵敏性。免疫印迹试验结果表明,此多克隆抗体仅可识别刀额新对虾蛋白中的Pen a 1蛋白,对所选其它物种蛋白无响应。【结论】通过人工合成多肽制备的抗体可用于目标致敏蛋白质的检测分析,该方法快捷灵敏,且具有较高的特异性。展开更多
以虾致敏蛋白Pen a 1（Tropomyosin）抗原表位为研究对象,建立了利用Pena 1表位抗体亲和纯化致敏蛋白的新方法.Fmoc法合成致敏Pen a 1蛋白的C端含有3个抗原表位的第247 ～284位氨基酸对应的多肽片段,应用马来酰亚胺法将多肽与KLH（匙孔...以虾致敏蛋白Pen a 1（Tropomyosin）抗原表位为研究对象,建立了利用Pena 1表位抗体亲和纯化致敏蛋白的新方法.Fmoc法合成致敏Pen a 1蛋白的C端含有3个抗原表位的第247 ～284位氨基酸对应的多肽片段,应用马来酰亚胺法将多肽与KLH（匙孔血蓝蛋白）、BSA（牛血清白蛋白）偶联制备人工免疫抗原（Pep-tide-KLH）和人工包被抗原（Peptide-BSA）,免疫人工抗原免疫纯种新西兰白兔,获得多克隆抗血清,抗血清经辛酸-硫酸铵及特异性血清纯化预装柱（HiTrap rProtein A FF）纯化后与溴化氰活化琼脂糖凝4B（CNBr-Activated Sepharose 4B）进行偶联.ELISA（酶联免疫吸附试验）测定该多克隆抗体效价为2.05×106,多肽对抗体的IC50（50％抑制浓度）为0.21 mg/L,交叉试验表明该抗体与虾中非Pena 1蛋白无交叉反应性;Bradford法测定CNBr-Activated Sepharose 4B与抗体的偶联率为90.76％.间接竞争ELISA测定1 mL偶联介质的吸附容量为2.84 mg Pen a 1,免疫亲和柱的加标回收率为89.6％～93.6％,亲和柱使用寿命为4次.展开更多
文摘【目的】建立一种识别、检测致敏蛋白的新方法。【方法】Pen a 1为虾中主要的致敏蛋白,从其5个主要IgE结合区中选择一段具有代表性的(85—105位)含21个氨基酸的多肽序列,进行化学合成,将多肽分别与匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)偶联,制得免疫原和包被原,免疫原免疫新西兰纯种白兔得到多克隆抗体。以刀额新对虾蛋白、卵清蛋白、花生蛋白和牛奶蛋白为样品,免疫印迹鉴定多克隆抗体对刀额新对虾中Pen a 1蛋白的特异性。【结果】经Ellman试剂测定多肽与KLH、BSA的偶联比分别为12﹕1和8﹕1。间接非竞争ELISA测定多克隆抗体的效价达1.024×106,间接竞争ELISA(icELISA)测定该多克隆抗体对多肽的IC50和IC10分别为0.4324μg.mL-1和0.0004μg.mL-1,表明多克隆抗体对多肽具有较强的灵敏性。免疫印迹试验结果表明,此多克隆抗体仅可识别刀额新对虾蛋白中的Pen a 1蛋白,对所选其它物种蛋白无响应。【结论】通过人工合成多肽制备的抗体可用于目标致敏蛋白质的检测分析,该方法快捷灵敏,且具有较高的特异性。
