改良成年小鼠心室肌细胞分离方法

目的 改进小鼠成体心肌细胞的分离方法,以提高小鼠心室肌细胞的成活率和收获量.方法 采用心脏在体主动脉插管,行独创的前加压灌流法冲洗心脏后接入改进的langendorff装置,用胶原酶液Ⅱ灌流、消化心脏后,将心脏剪碎并用吸管吹打,经200目滤网过滤后获得单个小鼠心室肌细胞.检测并对比在体和离体主动脉插管获得的心肌细胞的状态：梯度复钙后,在倒置显微镜下观察细胞的形态和杆状心室肌细胞的数目.结果 研究结果显示,改良的主动脉逆行灌流法在缩短手术时间的同时,提高了小鼠心室肌细胞收获量和存活率.本课题组利用医用三通管,独创倒置灌流排气法,可以迅速排空灌流装置中的气体;利用注射器和灌流针结合,独创前加压灌流法,可以快速彻底地冲洗心脏中的血液;并采用实验室常规眼科镊和血管钳巧妙组合成协助装置,可以单人独立完成插管,不需要助手协助,节约人力,节省经费开支.结论 成年小鼠心室肌细胞分离方法的改进使整个实验流程简化,缩短了实验时间,操作简便易学;同时该分离方法稳定、可靠、有效,可以为同类型实验提供思路和借鉴.

血管紧张素Ⅱ1型受体自身抗体对妊娠大鼠血管损伤的研究

背景和目的子痫前期是一种妊娠期特发的严重疾患，以全身血管内皮损伤、张力增加为基本病变。近年来研究发现，一种病理性的血管紧张素II1型受体（ATlR）自身抗体（ATl-AA），通过特异性识别结合ATlR细胞外第2环肽段，参与了子痫前期的发生发展，但作用机制尚不十分清楚。血管上分布有高密度的ATlR，因此本研究旨在观察ATl-AA是否会直接损伤孕鼠的血管功能，进而参与子痫前期的发生发展。方法收集临床子痫前期患者血清，免疫亲和层析法提纯ATl-AA，用ATl-AA被动免疫孕13天Wistar雌鼠，孕15天加强免疫1次，建立子痫前期孕鼠模型。检测体内ATl·AA滴度，监测尿蛋白及血压变化情况。同时设立生理盐水对照组、ATl一AA被动免疫＋氯沙坦组。在孕19天取各组孕鼠肠系膜动脉3级分支，微血管环技术检测血管内皮及平滑肌依赖的舒张功能。结果与生理盐水对照组相比，ATl-AA被动免疫组孕鼠血清中ATl·AA滴度升高（OD：0．80比O．33，P〈0．05，n=3），血压有升高趋势（115mmHg比94mmFlg，P〈0．05，Yt=3），尿蛋白含量升高（随机尿蛋白≥＋）：肠系膜动脉3级分支内皮依赖性舒张功能降低（67％比95％，P〈0．05，n=3），肠系膜动脉3级分支平滑肌依赖性舒张功能降低（70％比97％，P〈0．05，n=3）。而给予氯沙坦之后血压回转（98mmHg比115mmHg，P〈0．05，n=3），尿蛋白含量阴性（一），内皮（89％比67％，P〈0．05，n=3）及平滑肌（90％比70％，P〈0．05，n=3）依赖性血管舒张功能改善。结论本研究提示，在子痫前期孕鼠模型阻力血管舒张功能障碍中ATl-AA发挥了重要作用，其损伤机制可能与ATl一AA作用于血管内皮及平滑肌中的A¨R有关。

异丙肾上腺素对大鼠心脏功能的动态影响

目的观察异丙肾上腺素（ISO）对在体大鼠心脏功能、心室肌细胞功能以及胞内相关下游蛋白表达的动态影响。方法采用血流动力学方法及乳鼠心肌细胞培养,观察ISO对在体及离体大鼠心肌收缩能力的影响;通过Fura-2荧光探针法观察ISO对成鼠心肌细胞内游离钙水平的影响;Western blot检测ISO下游胞内相关蛋白表达水平的变化。结果 （5~500）nmol/L ISO对成鼠在体心功能有一个剂量依赖性增强效应,100nmol/L为其最佳实验浓度：0.1μmoI/LISO作用大鼠心室肌细胞（1 000~1 200）s,胞内游离钙水平达高峰。0.1μmoI/LISO作用于乳鼠心肌细胞30min可使其跳动频率达高峰,维持至60min后开始下降,与胞内钙变化规律一致。心室肌细胞内钙调蛋白激酶Ⅱ（Calmodulin kinaseⅡ,CaMKⅡ）水平在ISO干预后3h达高峰;G蛋白偶联受体激酶2（GRK2）和β-arrestin也在ISO作用后48h达高峰。结论 ISO可通过兴奋胞内Ca2＋-CaMKⅡ信号通路参与心肌细胞功能活动的动态调节;同时,ISO长期作用可升高胞内GRK2-β-arrestin水平,参与受体的脱敏调节。

高职高专“生理学”混合式教学设计与探究——以“血型与输血”为例

随着"互联网+"时代的来临,基于翻转课堂、在线教学平台等多种信息化教学模式相继涌出,如何依托信息化资源开展新形势教学模式已成为当今研究热点。生理学是医学院校专业基础主干课程,理论知识抽象难懂。为适应护理专业人才培养需要,本文以高职、高专生理学教学中"血型与输血"的混合式教学设计为例,探索生理学信息化教学新途径。

虚拟实验在高职高专机能实验教学改革中的探索

虚拟实验以计算机网络为核心,以实现数据采集、分析,远程操作的系统;通过虚拟现实、多媒体和仿真等技术,进行的仿真实验,强化实验教学信息化建设,建成以教学过程可视化、质量控制、师生互动、远程指导、自主学习等一体的泛在信息化云平台。虚拟实验教学作为新型实验教学平台,能节约实验成本,能增加学生的兴趣,调动学生做实验的积极性,虚拟仿真实验技术作为传统实验教学的辅助手段之一,可将虚拟实验与真实实验结合,做到"虚实结合、能实不虚"。

基于网络教学平台的PDG教学模式在人体生理学教学中的应用研究

目的:分析基于网络教学平台的PDG(Problem-discuss-guidance)教学模式在人体生理学教学中的应用的效果。方法:随机选取我校2018级临床医学专业四个班的216名学生作为研究对象,完全随机分组法分成两组,对照组和实验组(n=108)。1.2班是对照组;3.4班是实验组。对照组接受传统教学法,实验组接受PDG教学法。借助试卷理论考核成绩和问卷调查两种指标进行教学效果的评价和比较。结果:总体上,PDG组优于传统教学组(P<0.01)。结论:PDG教学模式可以提高学生综合分析、解决问题能力,团队协作能力和自主学习能力,在医学生理学教学中具有可推广型。

小鼠c-Kit和Sca-1阳性干细胞的多器官年龄分布特征

目的本研究旨在研究c-Kit和Sca-1两种干细胞亚型在小鼠多脏器的年龄分布规律,为后续进行相关组织的干细胞抗损伤研究奠定基础。方法选取C57/BL6雄性成年小鼠(3月龄、6月龄、9月龄),分离其骨髓、肝脏、肾脏、肺及胰腺组织,采用组织块酶解法分选各脏器中直径小于30μm的细胞,用CD45、c-Kit及Sca-1荧光抗体标记细胞,流式细胞仪记录CD45^-c、-Kit^+以及CD45^-Sca^-1^+细胞百分比。结果在小鼠骨髓中,CD45^-c-Kit^+细胞数显著多于CD45^-Sca-1^+(P<0.05);而在肝、肾、肺和胰腺组织中,CD45^-Sca^-1^+的细胞数量远多于CD45^-c-Kit^+干细胞(P <0.05)。除胰腺组织,9月龄CD45^-Sca-1^+的细胞数目较3、6月龄有所升高外,其他组织中干细胞的年龄分布趋势差异不显著(P>0.05)。结论 CD45^-c-Kit^+和CD45^-Sca-1^+两种干细胞亚型在小鼠多脏器中均有存在,尤其是数量上占据优势的CD45^-Sca-1^+干细胞可能在多数器官的发育及修复中发挥重要作用。

促红细胞生成素通过提高Sca-1^(+)干细胞的功能参与小鼠心肌梗死的修复

心肌梗死(myocardial infarction, MI)是目前全球主要的死亡病因之一。随着临床治疗水平的提高,MI急性期的死亡率已显著下降,但其对心肌重构及心功能的长远影响仍无法有效防治。促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)是一种糖蛋白细胞因子,具有促进造血、抗凋亡和促血管生成的作用。研究表明EPO在心脏缺血损伤、心力衰竭等心血管疾病中发挥心肌保护作用,机制与促进心脏祖细胞活化有关。本研究旨在探讨EPO是否可通过增强Sca-1^(+)干细胞的活性促进MI的修复。通过直接注射法将达贝泊汀-α (darbepoetin alpha,一种长效EPO类似物,EPOanlg)注射到成年小鼠MI的交界区,观测MI面积、心脏重构及功能、心肌细胞凋亡及微血管密度变化。用磁性分选技术从新生和成年小鼠心脏中分离Lin-Sca-1^(+)干细胞,分别用于克隆形成能力及EPO效应的测定。结果显示,和单纯的MI组相比,在体应用EPOanlg可显著降低MI面积、心肌细胞凋亡率,减轻左室腔的扩张,同时提高心功能、增加冠状动脉微血管的数量。在离体实验中,EPO可促进Lin-Sca-1^(+)干细胞增殖和迁移,增强克隆形成能力,这一效应可能是通过EPO受体进一步活化下游的STAT-5/p38 MAPK信号通路实现的。以上结果提示,EPO可能通过促进Sca-1^(+)干细胞活化来参与MI的修复过程。

抗β_1肾上腺素受体自身抗体可导致大鼠肾脏损伤(英文)

自从在原发性扩张型心肌病患者血清中发现抗β1肾上腺素受体自身抗体(autoantibodies against the second extracellular loop ofβ1-adrenoceptor,β1-AABs)以来,自身免疫机制在心血管疾病发病中的作用日渐受到重视。本研究组前期研究显示血清β1-AABs阳性的成年大鼠部分出现尿潜血及尿蛋白阳性,但机制不清。因此,本实验选择直接静脉给入抗体来观察β1-AABs长期存在对大鼠肾脏结构和功能的影响及可能的机制。用人工合成的β1-肾上腺素受体细胞外第二环(β1-AR-ECII)抗原肽段免疫正常成年大鼠以获取β1-AABs。通过观察β1-AABs对乳鼠心肌细胞跳动频率的影响来反映其是否具有生物学活性。目的抗体经纯化后,通过静脉定期注入成年及老年大鼠体内以观察该抗体对大鼠肾脏结构和功能的影响;生化分析仪定期检测大鼠血清中尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,CR)和尿酸(uric acid,UA)水平,同时尿分析仪检测尿比重、尿潜血、尿蛋白及尿糖的变化情况,以反映肾脏功能的波动;HE和Masson三色染色观察肾脏结构的变化。同时将β1-AR-EGFP质粒转染至HEK293细胞中,观察β1-AABs通过作用于β1-AR对细胞坏死及凋亡的影响。结果显示:成年及老年大鼠血清中BUN、CR、UA的水平随着β1-AABs的不断给入而渐进性升高,BUN/CR比值随免疫的进行呈现下降趋势;成年大鼠在β1-AABs免疫后出现不同程度的蛋白尿、尿潜血及尿糖水平的升高;同时,HE及Masson三色染色显示:β1-AABs免疫24周后,成年及老年大鼠肾脏集合管周围均可见到大量炎细胞浸润,胶原纤维沉积增加。HEK293细胞的研究结果提示,β1-AABs可通过增加细胞caspase-3水平而促进细胞凋亡的发生,而对LDH活性影响不大。由此提示,β1-AABs长期存在可导致成年及老年大鼠肾脏结构和功能的损害。

新生小鼠Lin^- Sca-1^＋心脏干细胞分离培养方案的优化

心脏原位干细胞(cardiac stem cells,CSCs)治疗心肌梗死具有公认的疗效,但是其分离及培养技术尚不完善,这是制约其临床应用的关键技术问题。为解决这一问题,本研究旨在优化Lin^-(lineage-negative)Sca-1^+(stem cell antigen-1-positive)CSCs分离方案。用组织块酶解法(混合酶液)分离C57BL/6J新生(出生0～3天)小鼠Lin^- Sca-1^+ CSCs。在已有的研究基础上,严格控制消化时间、次数、温度、搅拌速度、离心时间和转速等多重因素,结合免疫磁珠分选获得纯度较高的Lin^- Sca-1^+ CSCs。此后,对分离纯化的原代细胞进行培养,优化培养基成分、换液时间和方式。采用流式细胞术及免疫荧光染色技术,检测分选细胞的纯度及传代培养细胞中Sca-1^+细胞的百分比。结果显示:(1)本法分离获得的Lin^- Sca-1^+ CSCs纯度高达(85.03±5.60)%;(2)离体培养过程中,细胞生长状态良好,原代培养5天开始有干细胞克隆球生成,培养7天即可铺满皿底,生长曲线显示,离体培养第3天细胞进入对数增长期;(3)免疫组化染色结果显示:干细胞特异性标志Sca-1的表达随着传代的进行有一定的衰减。流式细胞术检测结果显示,第一代、第三代和第五代培养细胞的Sca-1阳性率分别为(71.82±2.63)%、(58.38±3.70)%、(46.19±4.72)%。以上结果表明,本研究所建立的组织块酶解法结合免疫磁珠分选法可获得纯度较高的Lin^- Sca-1^+ CSCs,同时干细胞离体培养体系相对稳定。本研究所建立的分离及培养方法简单稳定、可靠有效,为进一步研究Sca-1^+ CSCs治疗心肌梗死奠定了良好的方法学基础。