基于分步偶联策略的抗原与CpG佐剂定点共价结合技术研究

目的 基于分步偶联策略,借助经典的马来酰亚胺-巯基交联反应与异肽键分子黏合方法(SpyTag/SpyCatcher系统),建立抗原与CpG佐剂的定点共价结合技术。方法 设计合成马来酰亚胺修饰的CpG-1018和N端加有半胱氨酸的SpyTag短肽,将二者于20℃振荡孵育以获得中间产物SpyTag-CpG。将SpyCatcher与蛋白抗原Omp19融合表达,通过亲和层析及凝胶过滤层析获得SpyCatcher-Omp19重组蛋白。通过本实验室构建的志贺菌多糖抗原SpyCatcher-OPS糖蛋白表达系统,获得SpyCatcher-OPS糖蛋白。将SpyTag-CpG分别与SpyCatcher-Omp19重组蛋白和SpyCatcher-OPS糖蛋白连接,获得CpG佐剂与抗原共价偶联终产物CpG-Omp19和CpG-OPS,经SDS-PAGE分离后,通过荧光分析验证终产物结构。结果 马来酰亚胺和FAM同时标记的CpG-1018和SpyTag连接后,SDS-PAGE检测结果可见对应于SpyTag-CpG交联产物的高相对分子质量条带。马来酰亚胺修饰的CpG-1018与SpyTag连接后,质谱分析结果显示,SpyTag-CpG的相对分子质量与其理论相对分子质量相符合。将中间产物SpyTag-CpG与蛋白抗原SpyCatcher-Omp19、多糖抗原SpyCatcher-OPS孵育连接后,考马斯亮蓝染色和FAM荧光检测均可见对应于终产物CpG-Omp19和CpG-OPS的高相对分子质量条带。结论 成功建立基于分步偶联策略的抗原与CpG佐剂定点共价结合技术,获得了CpG佐剂与两种不同类型抗原的偶联终产物CpG-Omp19和CpG-OPS,为未来开发质量可控的自佐剂疫苗奠定了基础。