奶山羊SCD基因CDS区的克隆、序列分析及过表达

【目的】研究奶山羊硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(stearoyl-CoA desaturase,SCD)在乳腺上皮细胞中对不饱和脂肪酸合成过程相关基因的调控及对细胞脂肪酸组成的影响。【方法】用RT-PCR方法从西农萨能羊乳腺组织中扩增SCD基因,进行序列分析和组织表达谱分析;构建重组腺病毒质粒,进行包装和扩增后,感染体外培养的奶山羊原代乳腺上皮细胞,实时定量检测相关基因的表达,western blotting检测蛋白变化,气相色谱-质谱联用分析细胞内脂肪酸组成变化。【结果】①获得了全长1 080 bp的山羊乳腺SCD基因CDS(GenBank登录号:GU947654)并对其进行了生物信息学分析;②奶山羊SCD基因在乳腺、肺和皮下脂肪组织中高表达,而在心脏、瘤胃和卵巢组织中的表达量较低;③成功构建了奶山羊SCD基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒液,重组腺病毒感染原代乳腺上皮细胞后,检测结果表明细胞中SCD基因过表达极显著,FASN、H-FABP、LEPR和LXRα等基因表达下调,而PPARγ和LPL基因的表达量显著性增加;④棕榈酸和硬脂酸的含量下降,不饱和脂肪酸含量上升。【结论】SCD基因在奶山羊乳腺中发挥着重要作用,FASN、H-FABP、LEPR、LXRα、PPARγ和LPL基因的表达与其相关,这些基因共同影响乳脂中脂肪酸的组成。

奶山羊间性个体的遗传鉴定及AFLP指纹图谱分析

【目的】分析奶山羊间性个体的遗传背景,探讨间性个体发生的遗传机制,为山羊性别调控以及性别决定的研究提供参考。【方法】通过核型分析、特异性性别调控基因(Sex-determining region of Y chromosome,SRY)的PCR扩增以及AFLP(Amplified fragment length polymorphism)指纹图谱分析等方法,研究西农萨能羊间性个体的遗传本质。【结果】间性山羊与正常母山羊的核型一致,为58+XX;间性个体基因组中未能扩增出SRY基因;AFLP指纹图谱分析发现,有9对引物扩增出清晰的条带,共1 833条,片段长度为70～500bp,9对引物的扩增结果差异明显,表现出丰富的多态性,共获得611个多态位点,占总扩增条带数的33.3%,但在基因组水平上间性山羊与正常母山羊个体并没有大的差异。【结论】根据试验结果推测,间性山羊的出现并非是由个体基因组发生突变造成的,可能是在性别决定过程中某个因子的调控出现差错,从而导致胚胎在发育过程中偏离雌性轨道而产生间性山羊个体,其具体机制有待进一步研究。

miR-200a对奶山羊乳腺上皮细胞乳脂合成相关基因mRNA表达的影响

旨在构建pAd-pri-miR-200a重组腺病毒,使其在奶山羊乳腺上皮细胞中稳定表达miR-200a,研究miR-200a对乳脂合成相关基因mRNA表达的影响。以西农萨能羊DNA为模板扩增pri-miR-200a。采用Ad-Easy系统构建重组腺病毒载体pAd-pri-miR-200a,并于HEK 293细胞株中进行病毒的包装、扩繁。TCI50法测定病毒滴度。qRT-PCR检测miR-200a及16个乳脂合成相关基因mRNA表达水平。序列分析结果显示,pri-miR-200a包括pre-miR-200a86bp和侧翼序列共297bp。酶切结果证实pAd-pri-miR-200a构建成功。Ad-pri-miR-200a滴度达8×109 PFU.mL-1。实时定量结果表明,Ad-pri-miR-200a(MOI为200)感染奶山羊乳腺上皮细胞72h,miR-200a的表达量较对照高出2.4倍。同时miR-200a的过表达引起10个基因mRNA表达量下调,6个基因mRNA表达量上调。其中脂肪酸从头合成相关基因FASN、脂滴生成相关基因TIP47及脂肪酸运输相关基因FABP4降幅较大,分别下降了0.47、0.89及0.65倍。而TAG生成相关基因DGAT1和脂解相关基因HSL较对照分别增加了0.52和1.49倍。本研究获得的重组腺病毒Ad-pri-miR-200a能在山羊乳腺上皮细胞中稳定表达miR-200a,同时miR-200a过表达影响乳脂合成相关基因mRNA表达水平。

西农萨能羊MAT基因的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备高特异性、高效价的乙酰/丙二酸单酰转移酶(MAT)多克隆抗体,为研究山羊MAT在脂肪酸代谢中的功能奠定基础。【方法】采用PCR方法扩增奶山羊的MAT基因,将其亚克隆到pET32a(+)载体得到pET32a(+)-MAT原核表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。使用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的MAT蛋白经复性后进行活性检测。采用皮下免疫法将纯化的MAT蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,用ELISA和Western blot检测血清多克隆抗体的效价和特异性。【结果】PCR扩增得到981bp的MAT基因编码区;成功构建了pET32a(+)-MAT原核表达载体,诱导表达获得了56ku的重组蛋白。活性检测表明,复性后的MAT具有转移酶活性,ELISA检测显示抗体效价达1∶128 000,经Western blot鉴定,制备的多克隆抗体能特异性检测原核表达的MAT蛋白以及在HEK-293细胞中表达的MAT蛋白。【结论】获得了具有酶活性的MAT蛋白以及高特异性、高效价的兔抗MAT多克隆抗体,为研究MAT在脂肪酸代谢中的功能提供了重要的试验工具。

山羊脂肪酸合酶基因(FASN)启动子结构与功能的初步分析

本研究旨在对山羊脂肪酸合酶基因(Fatty acid synthase,FASN)启动子进行结构与功能的初步分析,进而对其转录调控机制进行探讨。采用PCR技术从西农萨能羊基因组DNA中克隆FASN基因启动子,通过缺失分析,构建7个包含不同缺失片段的荧光素酶报告基因载体,转染山羊乳腺上皮细胞和MCF-7细胞,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动活性。结果表明,克隆得到FASN基因的启动调控序列2 589bp,生物信息学分析发现,该启动子序列含有典型的启动转录元件TATA-box和E-box,分别位于转录起始位点(+1)上游-41和-74bp处。报告基因分析表明,启动子核心区域定位在-293～-79bp,在线软件预测发现,该区域含有Sp1、NF-Y、USF和SREBP等转录因子结合位点。结果显示,FASN基因启动子前端存在负调控元件,Sp1、NF-Y、USF和SREBP等转录因子可能参与FASN基因的转录调控。

miR-200家族在西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达分析

笔者拟获得山羊miR-200家族乳腺组织表达谱,研究miR-200家族成员之间表达相关性及miR-200家族成员与山羊乳成分的相关性。通过定量PCR,检测miR-200家族在西农萨能奶山羊泌乳中期和干奶期乳腺组织中的表达量;利用Pearson相关系数分析miR-200家族不同成员表达量之间的相关性,同时分析miR-200家族成员与山羊乳成分之间的相关关系;利用miRanda和TargetScan 6.2软件分析、RNAhybrid和PITA软件预测miR-200家族的靶基因。结果表明,miR-200家族在奶山羊泌乳中期的乳腺组织中的表达量极显著高于干奶期(P<0.01);miR-200a与miR-141之间的表达量显著相关(P<0.05),miR-200b与miR-200c之间的表达量极显著相关(P<0.01);泌乳中期奶山羊乳腺组织中miR-200c的表达量与乳蛋白、非脂固形物(SNF)、冰点(FPD)的含量显著相关(P<0.05);经软件分析及预测发现,miR-200a/miR-141靶向作用于在乳脂合成中起关键作用的基因STAT4。miR-200家族可能对山羊乳蛋白及乳脂合成具有一定的调控作用。

陕西不同地区不同泌乳时期奶山羊乳成分分析

试验旨在研究陕西三个不同地区不同泌乳时期的关中奶山羊乳常规营养成分的差异。选取健康,产奶量、体重及胎次接近的高产关中奶山羊139只(分别为凤翔县46只,淳化县50只,白水县43只)为研究对象,测定其乳脂率、乳蛋白、干物质、非脂固形物及乳糖的含量,从而对不同地区和不同泌乳时期山羊乳常规营养成分的相对含量进行对比。结果表明:3个地区奶山羊乳中乳脂率、乳蛋白、干物质和非脂固形物的含量差异不显著(P>0.05)。随着泌乳时间的延长,各地区奶山羊乳中乳脂率、乳蛋白、干物质、非脂固形物均呈现出先下降后上升的趋势;乳中乳糖含量则随着泌乳时间的增加而呈现下降的趋势。这些结果对于统一不同地区羊奶的收购提供了一定的理论依据。

西农萨能羊乙酰/丙二酸单酰基转移酶基因重组腺病毒载体的构建

本研究旨在通过构建西农萨能羊脂肪酸合酶(FASN)基因乙酰/丙二酸单酰基转移酶(MAT)区域的重组腺病毒载体,为研究其在奶山羊乳腺上皮细胞中过表达以及功能和作用机制做准备。根据GenBank收录的西农萨能羊MAT序列设计引物,PCR扩增并克隆测序。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上并线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasyⅠ的E.coli Bj5183感受态细胞进行同源重组,得到重组腺病毒质粒pAd-MAT-HIS,并用PacⅠ酶切鉴定,将经过PacⅠ线性化的pAd-MAT-HIS转染HEK 293细胞进行病毒包装和扩增,用LaSRT法测定病毒滴度。将本次克隆的MAT序列与GenBank收录的山羊序列对比发现,在601bp处碱基由G转变为A,导致氨基酸序列由丙氨酸(Ala)201转变为苏氨酸(Thr)201。酶切鉴定、绿色荧光蛋白观察、PCR及Western blot检测均证明,重组腺病毒质粒构建成功,病毒滴度为2×109 PFU.mL-1。本研究成功构建了重组腺病毒pAdEasy-MAT-HIS。

奶山羊LXRα基因shRNA序列的筛选及腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】构建针对奶山羊肝脏X受体α(Liver X receptorα,LXRα)基因的干扰腺病毒载体。【方法】根据奶山羊LXRα基因CDS区域设计小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA),分别构建pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA及pDsRed1/C1-LXRα载体,共转染HEK 293细胞,48h后观察其荧光蛋白表达量,筛选出具有明显干扰效应的shRNA。将具有明显干扰效应的shRNA载体与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST在LR ClonaseTMⅡ重组酶的作用下进行重组,经氨苄青霉素及氯霉素抗性筛选后获得重组腺病毒载体。将构建好的重组腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化并回收后,转染HEK 293细胞,培养7～10d后收集细胞并反复冻融,收集细胞裂解液,反复扩增3次后,获得高滴度的重组腺病毒,测定其病毒滴度。【结果】①设计出了shRNA-490、shRNA-496、shRNA-509和shRNA-923 4条shRNA序列;②得到shRNA-490和shRNA-923 2条具有明显干扰效应的shRNA;③获得pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA-490和pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA-923 2个重组腺病毒载体,ScaⅠ酶切及测序结果均正确,2个腺病毒重组载体滴度均为5×108 PFU/mL。【结论】奶山羊LXRα基因重组shRNA腺病毒载体构建成功,为利用RNA干扰技术研究LXRα基因在乳腺上皮细胞中的功能奠定了基础。

乳腺特异性共表达4种脂肪酸合成酶载体及其稳转山羊成纤维细胞系的构建

为改善山羊乳品质,创制乳汁中富含n-3不饱和脂肪酸的奶山羊育种新材料,首先构建了一种山羊乳腺特异性表达载体,以实现n-3不饱和脂肪酸合通路中4种脂肪酸合成酶基因(fat-1,fads2,elovl5和scd-1)的共表达。为初步验证该载体的有效性,通过脂质体法转染小鼠乳腺上皮细胞系C127,经G418筛选收集阳性C127转基因细胞,并对其进行反转录PCR(RT-PCR)检测。结果表明,4种基因均可在C127细胞转基因中表达。将该多基因共表达载体转染奶山羊成纤维细胞,通过G418筛选获得了稳定转染的细胞系。PCR结果显示,4个目的基因均成功整合到奶山羊成纤维细胞基因组中。总之,本研究成功构建了乳腺特异性共表达4种脂肪酸合成酶转基因载体及其山羊转基因细胞系,为创制乳腺特异性表达多不饱和脂肪酸的转基因奶山羊奠定了基础。

乳腺脂肪组织调节乳腺发育的研究进展

乳腺是哺乳动物哺育子代的重要器官,其通过分泌乳汁给子代提供充足的营养物质,乳腺的健康发育对泌乳以及提高子代的存活率具有重要意义.脂肪组织是乳腺重要的组成部分,在乳腺发育和循环重构过程中,乳腺脂肪组织随之呈现规律性的形态和功能变化,乳腺脂肪组织的动态变化是乳腺循环性发育重构的重要特征.脂肪组织能够分泌特殊的"脂肪因子"调节上皮细胞的功能和乳腺的发育,并且存在与上皮细胞相互转换的潜能.本综述综合近年来乳腺脂肪组织的相关研究进展,为后续研究脂肪组织调节乳腺发育的机制提供基础数据.

研究型教学模式在生物制药本科专业综合实验中的探索与应用——以抗菌肽的高效制备与活性分析为例

通过设计本科综合实验教学项目抗菌肽的高效制备与活性分析,针对研究型教学元素对教学内容、教学方法和考核模式进行了优化改革,以学生的自主实验探索与学习为中心,着重培养学生分析问题和解决问题的能力,强化对学生创新性思维能力的培养。研究型教学模式的探索和应用对提高生物制药本科生的综合实验能力和科研思维训练具有重要的作用,有利于学生更好地适应新时代生物制药产业发展对高素质生物医药人才的需求。

乳腺重构的过程及其调节因素

受到妊娠周期的影响,乳腺组织在雌性哺乳动物一生中经历着妊娠-哺乳-退化的周期性发育变化.在乳腺退化到再次泌乳的过程中,乳腺细胞经历凋亡和更新,从而实现乳腺组织的自我更新和修复,即乳腺重构.重构期间乳腺在组织结构和生理过程中发生显著变化,但该过程物种间差异较大.乳用家畜为维持泌乳,妊娠期和干奶期重叠,展示出独特的再生性乳腺重构.再生性乳腺重构对乳畜乳腺健康和下一周期的泌乳具有重要意义,研究此过程将为后续调控乳腺自我更新和改善乳腺健康提供思路.本综述总结了近年来动物乳腺重构的研究进展,系统归纳了影响乳腺重构的因素,包括激素、蛋白酶、细胞因子、热应激、氧化应激、光照周期等,旨在解析乳腺重构的生理机制,为精准调控该过程提供科学依据.

山羊SREBP-1基因的超表达对脂肪酸代谢相关基因表达的影响

本研究旨在通过构建西农萨能羊固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)基因的重组腺病毒超表达载体,获得有感染性的病毒颗粒,并检测该基因过表达后对乳腺上皮细胞中脂肪酸代谢相关基因的影响,为进一步研究该基因在脂肪酸代谢及泌乳调控中的功能奠定基础。根据GenBank中收录的西农萨能羊SREBP-1基因的序列设计引物,PCR扩增后进行测序。将测序正确的目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV后并进行线性化,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌Escherichia coli BJ5183感受态细胞中进行同源重组,将重组成功的质粒进行PacⅠ酶线性化,转染HEK 293细胞进行重组腺病毒的包装、扩繁及滴度测定。病毒液感染原代乳腺上皮细胞,实时荧光定量检测SREBP-1超表达效果及对脂肪酸代谢相关基因的影响。结果表明:重组腺病毒质粒构建成功,腺病毒滴度为109U/mL。病毒液感染乳腺上皮细胞48 h后,SREBP-1基因表达量上升大约15倍,72 h后,表达量上调了30倍;对脂肪酸代谢相关基因的影响在72 h较为明显,其中,脂肪酸合酶(FASN)及酰基辅酶A羧化酶(ACC)均显著上调了大约两倍,过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)上调了大约1.5倍,肝素X受体(LXRα)及甘油三酯水解酶(ATGL)表达量升高了1.2倍;其中硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)表达水平无明显变化。表明在西农萨能羊乳腺上皮细胞中,SREBP-1能够促进脂肪酸合成相关基因的表达,对山羊乳腺脂肪酸代谢具有调控作用。

不同蛋白水平对西农萨能羊泌乳性能的影响

本试验旨在探求西农萨能羊饲料中最合适的蛋白水平,以充分发挥奶山羊的泌乳性能、提高山羊的奶品质。试验采用单因素试验设计,选择处于泌乳盛期体重、胎次、泌乳量接近的健康西农萨能羊,随机分成3组,每组11只。固定能量水平为12.51 MJ/kgDM,蛋白水平分别为10%、14%和18%。试验期共100 d,预试期10 d,正试期90 d。结果表明:随着试验的进行,各组产奶量呈下降趋势,10%蛋白水平组下降幅度最大,14%蛋白组次之,18%蛋白组下降幅度最小;各试验组乳成分分析表明,18%蛋白组中乳脂、乳糖和全脂固形物降低幅度最明显,10%蛋白组降低幅度次之,14%蛋白组降低幅度最小。本试验中同等能量水平,不同蛋白水平对奶山羊产奶量和乳成分影响差异不显著(P>0.05)。

西农萨能羊脂肪分化相关蛋白(ADRP)基因的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

在大肠杆菌中表达西农萨能羊脂肪分化相关蛋白(ADRP),并制备其多克隆抗体。以实验室保存的pMD19-T-ADRP质粒为模板,扩增ADRP的CDS区,将其克隆到pET32a(+)载体,阳性克隆转化到大肠杆菌菌株E.coli BL21(DE3)中诱导表达,优化融合蛋白表达条件,使用Ni-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的ADRP蛋白经复性后免疫兔子制备多克隆抗体,ELISA和Western blot检测血清效价和特异性。结果表明:成功构建pET32a(+)-ADRP原核表达载体并诱导其表达,获得最佳表达条件,即37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h;ELISA检测显示抗体效价达1∶64 000;经Western blot鉴定,制备的多克隆抗体能特异性结合原核表达以及乳腺上皮细胞表达的ADRP蛋白。本实验成功表达、纯化了ADRP融合蛋白,获得具高特异性、高效价的兔抗ADRP多克隆抗体。