布鲁菌gntR4基因无痕缺失株构建及其生物学特性分析

布鲁菌是兼性胞内寄生菌,其入侵宿主细胞后的胞内存活能力决定着布鲁菌的毒力,布鲁菌毒力因子功能的研究对阐明其致病机制具有重要意义。在前期研究中利用转座子随机突变技术发现转录调控子GntR4与布鲁菌毒力相关,故进一步通过定向缺失方法构建布鲁菌gntR4基因无痕缺失株,并通过耐受性试验、免疫印迹试验、胞内存活试验、小鼠致病性试验等对gntR4缺失株的基本生物学特性进行评估。结果表明:gntR4缺失显著减弱布鲁菌抵抗阳性杀菌肽的能力,说明GntR4可能调控部分基因帮助布鲁菌抵抗宿主非特异性免疫杀伤。但GntR4与T4SS的表达无关,与布鲁菌在胞内的存活能力及对小鼠的致病力无关。综上,这一研究构建的基因无痕缺失方法为布鲁菌基因功能研究奠定基础,针对GntR4调控子的研究完善了GntR调控子家族的功能研究,为阐明布鲁菌抵抗宿主免疫杀伤与建立慢性感染机制间的关系提供依据。

流产布鲁菌转录调控子ArsR6缺失株的构建及其生物学特性分析

布鲁菌病是一种由布鲁菌感染引起的人畜共患传染病。布鲁菌是兼性胞内寄生的革兰氏阴性菌,其适应宿主环境、在胞内存活并建立慢性感染依赖于多种基因的表达和调控。前期研究利用转座子随机突变技术发现了转录调控子ArsR6与流产布鲁菌毒力相关,本研究通过基因定向缺失方法构建了流产布鲁菌arsR6基因卡那霉素抗性标记缺失株,并通过耐受性试验、免疫印迹试验、胞内存活试验、小鼠致病性试验等对arsR6缺失株的基本生物学特性进行了评估。结果显示,arsR6缺失显著减弱了布鲁菌抵抗阳性杀菌肽的能力,此外,arsR6缺失株的T4SS表达量增加,胞内存活能力增强,感染小鼠早期脾脏载菌量增加,慢性感染阶段导致小鼠脾脏显著肿胀,以上结果表明,ArsR6是布鲁菌毒力相关的重要转录调控子,本研究为布鲁菌致病机制研究提供参考。

禽源大肠埃希菌ETT2毒力岛Duplex PCR检测

禽致病性大肠埃希菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)的毒力基因较为复杂,其中ETT2(Escherichia coli type three secretion system 2)毒力岛在禽源大肠埃希菌鲜有报道。选择ETT2两端的ECs3703和ECs3737作为检测标志基因,参照文献合成2对引物,建立Duplex PCR方法用于快速检测携带ETT2的禽源大肠埃希菌。通过对参考菌株的扩增,建立特异的Duplex PCR快速检测方法。通过对187份临床样品的检测,发现其中77份(41.2%)样品存在ETT2阳性大肠埃希菌感染;通过对247株禽源大肠埃希菌临床分离株的检测,发现46.9%的禽源大肠埃希菌携带ETT2毒力岛。

一种基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性质粒的构建及应用

[背景]布鲁菌病是由布鲁菌感染引起的一种人兽共患传染病,对畜牧业发展和人类健康有着巨大的威胁。利用新型报告基因NanoLuc荧光素酶构建一种可以检测布鲁菌基因启动子活性的质粒,对于研究布鲁菌毒力基因的调控表达具有重要意义。[目的]制备NanoLuc荧光素酶多克隆抗体,构建一种基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性的质粒,并通过测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性验证该方法的可行性。[方法]构建NanoLuc荧光素酶原核表达载体pET-Nluc,纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体;以广宿主质粒pBBR1MCS为骨架,构建质粒pNluc、pBcsp31-Nluc和pVirB-Nluc,通过电转化构建S2308(Nluc)、S2308(Bcsp31-Nluc)和S2308(VirB-Nluc)重组菌株,在体外培养条件下测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性;比较分析virB启动子在胞内感染条件下和体外培养条件下的活性。[结果]通过原核表达获得NanoLuc荧光素酶重组蛋白,并制备得到效价高于1:100 000的多克隆抗体;成功构建pNluc、pBcsp31-Nluc和pVirB-Nluc质粒以及S2308(Nluc)、S2308(Bcsp31-Nluc)和S2308(VirB-Nluc)重组菌株;体外培养条件下测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性,结果显示pNluc质粒可以精确报告其活性;测定virB启动子在胞内诱导条件下和体外培养条件下的活性,结果显示virB启动子活性在胞内感染条件下明显增强。[结论]构建了基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性的质粒,并验证其可以精确反映布鲁菌基因启动子活性,为研究布鲁菌毒力基因以及揭示其致病机制奠定了基础。