基于PD-1/PD-L1表达影响探讨四君子汤对NK细胞及结肠癌作用的研究

目的:通过四君子汤探讨PD-1/PD-L1的表达对NK细胞活性、结肠癌细胞HCT116增殖的影响及作用机制。方法:①通过人外周血淋巴分离液分离出NK细胞,构建NK细胞∶HCT116细胞=5∶1的共培养模型,将经200 ng/ml IFN-γ处理的NK细胞设为IFN-γ组,200 ng/ml IL-2处理的NK细胞设为IL-2组(阳性对照组),5 mg/ml四君子汤处理的NK细胞设为SJZ组,100μmol/L奥沙利铂处理的NK细胞设为OXA组(阳性对照组),正常处理的NK细胞设为Con组,分别单独培养NK细胞,与HCT116细胞共培养24 h及48 h,MTT法检测NK细胞及HCT116细胞的增殖情况;加入STAT3信号抑制剂后,即为R-STAT3组、R-SJZ组、R-OXA组。ELISA检测NK细胞及共培养模型中IFN-γ的分泌情况;qRT-PCR检测共培养模型中NK细胞mRNA IFN-γ、STAT3、PD-1的表达以及HCT116细胞中STAT3、PD-L1 mRNA的表达;②建立小鼠结肠癌皮下瘤模型,将小鼠随机分为4组,空白组(CON)、生理盐水组(NACL)、四君子汤组(SJZ)、奥沙利铂组(OXA),分别给药2周后,活体成像技术检测小鼠皮下瘤的荧光强度;ELISA检测小鼠血液中IFN-γ的分泌量;qRT-PCR、Western blot与免疫组化实验分别检测小鼠皮下瘤中PD-L1 mRNA、蛋白及抗体的表达情况。结果:①IFN-γ在一定浓度下可以抑制NK细胞的生长(P<0.05),四君子汤对共培养模型中HCT116具有显著的抑制作用(P<0.01);四君子汤单独使用或与STAT3抑制剂联合使用可有效降低IFN-γ分泌(P<0.05);四君子汤单独使用或与STAT3抑制剂联合使用可降低共培养模型NK细胞中IFN-γ、PD-1、STAT3及HCT116细胞中PD-L1、STAT3 mRNA的表达;②在小鼠动物实验中,四君子汤组的肿瘤荧光强度弱于生理盐水组和空白组(P<0.05);皮下瘤中PD-L1蛋白及抗体低表达(P<0.05),PD-L1的mRNA表达与细胞实验结果一致(P<0.01),且小鼠血液中的IFN-γ在四君子汤组分泌量最低(P<0.05)。结论:四君子汤可以影响NK细胞活性及结肠癌增殖,其功能与STAT3抑制剂相近,可能通过调控STAT3信号干预IFN-γ分泌,降低PD-1/PD-L1表达从而改善NK细胞及抑制结肠癌细胞的生长。