真核表达的人Y盒结合蛋白1(YB-1)促进人HepG2肝癌细胞的增殖和迁移

目的构建带有FLAG标签的Y盒结合蛋白1(YB-1)真核表达载体,转染至HepG2肝癌细胞探究YB-1对肝癌细胞增殖和迁移的影响。方法以人卵巢文库为模板并采用PCR扩增出YB-1基因片段,经双酶切后与pcDNA3.0-FLAG载体连接,构建pcDNA3.0-FLAG-YB-1真核表达载体;将其转染至HepG2细胞,通过Western blot法验证YB-1在HepG2细胞的表达;CCK-8法和集落形成实验验证YB-1对HepG2细胞生长的影响;划痕实验验证YB-1对HepG2细胞迁移的影响。结果成功构建出pcDNA3.0-FLAG-YB-1真核重组表达载体,且能在HepG2细胞中表达YB-1蛋白;YB-1能够促进HepG2细胞的增殖和迁移。结论YB-1促进HepG2细胞的增殖和迁移。

丙酮酸脱氢酶E1亚基α1在肾透明细胞癌中的表达及影响

背景肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)的代谢特征之一是进行有氧糖酵解,探讨糖代谢通路的关键蛋白对ccRCC的影响具有重要临床意义。目的探究丙酮酸脱氢酶E1亚基α1(pyruvate dehydrogenase E1 subunit alpha 1,PDHA1)在ccRCC中的表达及对ccRCC预后的影响,并在体外细胞实验中检测PDHA1对ccRCC细胞系786-O生长、增殖和迁移的影响。方法检索TCGA数据库中的转录组数据,分析PDHA1在ccRCC和癌旁组织中的表达水平,并根据肿瘤分期、分级和淋巴细胞转移情况,比较PDHA1表达差异。应用Kaplan-Meier法分析PDHA1表达与肿瘤预后的关系,通过基因富集分析,预测PDHA1在肿瘤中发挥功能的信号通路。体外细胞实验,Western blot验证786-O转染后PDHA1的蛋白表达情况。通过CCK-8法、克隆形成及划痕实验,检测PDHA1对786-O细胞生长、增殖和迁移的影响。结果TCGA数据库显示,相比于癌旁组织,ccRCC组织的PDHA1 mRNA水平明显下降,PDHA1的mRNA水平也与ccRCC的分期和分级有关(P<0.01)。PDHA1高表达组有较长的无病生存期和总生存期(P<0.01);体外细胞实验结果表明,与空载体相比,高表达PDHA1后,786-O细胞增殖、克隆形成和迁移能力均明显减弱(P<0.01)。结论PDHA1表达与ccRCC患者预后正相关,在抑制肿瘤细胞生长、增殖及迁移中发挥了重要作用。

透明质酸介导运动受体真核表达载体的构建及其对乳腺癌增殖和迁移的影响

目的构建透明质酸介导运动受体(HMMR)真核表达重组质粒并在乳腺癌ZR75-1细胞中转染和鉴定,探究HMMR对乳腺癌细胞生长、增殖和迁移的影响。方法采用PCR技术以人乳腺文库为模板扩增HMMR基因并与pcDNA3.0-FLAG载体在EcoRⅤ和XhoⅠ酶切位点进行连接,构建真核表达载体(pcDNA3.0-FLAG-HMMR),并转染乳腺癌ZR75-1细胞;通过Western印迹法、CCK8实验和克隆形成检测HMMR基因表达对ZR75-1生长的影响,划痕实验验证真核表达载体对ZR75-1细胞迁移的影响。结果经酶切鉴定及序列测序验证真核重组表达载体构建成功,并在ZR75-1细胞中表达;并且发现HMMR对ZR75-1细胞的增殖和迁移具有显著的促进作用。结论构建的真核表达载体转染至ZR75-1细胞后,明显促进ZR75-1增殖和迁移,这为研究HMMR基因在乳腺癌发生发展机制奠定了基础。

细胞自噬与肿瘤发生发展

自噬是真核生物中一种高度保守的胞内降解途径。其主要通过溶酶体或液泡进行饥饿状态下的营养动员,清除受损蛋白质、细胞器和胞内病原体。自噬主要包括巨自噬、分子伴侣介导自噬(CMA)和微自噬。自噬已被证实与多种人类疾病相关,其在肿瘤发生发展中具有重要意义。近年研究中,对于自噬和肿瘤关系有了进一步的认识,该文就自噬分子机制、调控通路以及与肿瘤发生发展关系的研究进展作一综述。

稳定低表达乳酸脱氢酶A对HepG2和ZR-75-1细胞糖代谢、增殖和迁移的影响

目的通过构建乳酸脱氢酶A(LDHA)稳定低表达的HepG2和ZR-75-1细胞系,观察LDHA表达降低对肝癌细胞HepG2和乳腺癌细胞ZR-75-1糖代谢、增殖、迁移的影响。方法采用慢病毒介导的LDHA-shRNA载体,将新构建质粒转染至HEK293T细胞中检测抑制效果,实时定量PCR检测LDHA mRNA水平,Western印迹检测蛋白水平。对经嘌呤霉素筛选后感染慢病毒的稳定低表达LDHA的HepG2和ZR-75-1细胞进行功能测定,利用糖代谢相关试剂盒检测敲低后肿瘤细胞中糖摄取、三磷酸腺苷(ATP)、乳酸脱氢酶(LDH)、乳酸水平;利用生长曲线实验和克隆形成实验检测LDHA基因表达降低对细胞增殖的影响;利用划痕实验检测LDHA表达降低对细胞迁移能力的影响。结果实时定量PCR及Western印迹结果显示,LDHA表达在mRNA水平及蛋白水平上均受到了抑制;糖代谢相关试剂盒检测结果表明稳定低表达LDHA的肿瘤细胞中糖摄取、ATP水平、LDH和乳酸水平均明显下降;生长曲线实验(CCK-8法)和克隆形成实验显示,慢病毒介导的LDHA shRNA能明显抑制肿瘤细胞的增殖;划痕实验显示,敲低LDHA后HepG2和ZR-75-1细胞迁移能力受到了明显抑制。结论 LDHA表达降低可明显抑制肿瘤细胞中糖摄取、ATP、LDH和乳酸水平并且抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。

泛素特异性蛋白酶USP18在肺腺癌中的表达及其影响研究

目的拟探讨泛素特异性蛋白酶USP18在肺腺癌中的表达及其对人肺腺癌细胞A549增殖、迁移能力的影响。方法基于癌症数据库TCGA-LUAD中的转录组数据,分析USP18在肺腺癌中的表达量;通过基因富集分析,探索USP18在肺腺癌发生发展中的功能。利用人肺腺癌A549细胞过表达USP18蛋白,生长曲线、克隆形成以及划痕实验探究USP18对A549细胞增殖、迁移能力的影响。结果在TCGA-LUAD数据库中,相比于癌旁组织,肺腺癌组织的USP18 mRNA水平明显升高;细胞生长曲线和克隆形成实验结果显示,转染Flag-USP18的人肺腺癌A549细胞较转染空载体细胞增殖能力增强;划痕实验显示,转染Flag-USP18的人肺腺癌A549细胞较转染空载体细胞迁移能力增强。结论肺腺癌细胞中USP18表达增强,且高表达的USP18可增强肺腺癌细胞增殖、迁移能力。

人乳酸脱氢酶A基因的原核表达及其蛋白的纯化

目的构建带有His标签的人乳酸脱氢酶A(LDHA)基因原核表达载体,并进行蛋白纯化,为研究LDHA蛋白功能奠定基础。方法以人乳腺文库作为模板,通过PCR技术扩增得到LDHA基因的编码序列,插入到pET-28a(+)载体中并测序。LDHA在大肠杆菌中进行诱导表达并纯化蛋白,SDS-PAGE及Western印迹检测蛋白纯化效果。采用His pull-down技术检测纯化蛋白与沉默信息调节因子2(SIRT2)的相互作用。结果PCR扩增获得长度约1000 bp的LDHA编码序列,并插入到pET-28a(+)载体中,序列测定结果显示重组质粒构建成功。SDS-PAGE及Western印迹结果显示获得带有His标签的LDHA蛋白。His pull-down实验证明His-LDHA能与SIRT2体外结合,证实其生物学活性良好。结论成功构建带His标签的LDHA基因原核表达载体,并得到纯化蛋白,为进一步研究LDHA蛋白的功能奠定了基础。