猪德尔塔冠状病毒M蛋白参与病毒诱导IL-8产生的研究

为研究猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)感染能否诱导宿主细胞产生IL-8,本研究将PDCoV分别感染猪小肠上皮细胞(IPEC)和ST细胞,感染后6 h、12 h和24 h收集细胞,通过荧光定量PCR方法检测IL-8 mRNA转录水平。构建表达PDCoV M蛋白的真核表达质粒pCAGGS-M,经测序鉴定无误后转染HEK 293T细胞,采用间接免疫荧光试验(IFA)和western blot方法检测PDCoV M蛋白的表达。将pCAGGS-M质粒转染IPEC细胞,采用荧光定量PCR方法检测PDCoV M蛋白对IL-8转录的影响。为进一步评价PDCoV M蛋白对IL-8转录水平的影响,将不同浓度pCAGGS-M质粒(10 ng、100 ng和200 ng)、IL-8启动子质粒和pRL-TK质粒共转染HEK 293T细胞,采用双荧光素酶活性分析试验评价PDCoV M蛋白对IL-8转录活性的影响。荧光定量PCR结果显示,与未感染组相比,PDCoV感染能够显著上调细胞中IL-8 mRNA转录水平,其中PDCoV感染IPEC细胞6 h、12 h和24 h后IL-8 mRNA分别上调3倍、37倍和173倍;PDCoV感染ST细胞6 h、12 h和24 h后IL-8 mRNA分别上调20倍、19000倍和48000倍。IFA和western blot结果显示PDCoV M蛋白正确表达,与空载体质粒转染组相比,转染表达PDCoV M蛋白的质粒能够上调IPEC细胞IL-8转录水平约4.3倍。双荧光素酶活性分析试验结果显示,与对照组相比,转染10 ng、100 ng和200 ng pCAGGS-M质粒能够分别诱导细胞中IL-8转录活性上调1.9倍、3.8倍和5.7倍;表明PDCoV M蛋白能够上调宿主细胞IL-8的转录活性。综上所述,PDCoV感染能够显著上调IPEC和ST细胞中IL-8的转录水平,其中PDCoV M蛋白参与诱导细胞IL-8的产生,本研究为深入了解PDCoV致病机制提供参考依据。

猪流行性腹泻病毒通过下调FBXW7拮抗宿主抗病毒天然免疫应答的研究

为研究E3泛素连接酶FBXW7与PEDV感染的相互调节作用,本研究采用PEDV感染Vero E6细胞后检测FBXW7蛋白表达水平,结果显示,PEDV感染能够抑制Vero E6细胞中FBXW7的表达水平。将pCAGGS-HAFBXW7转染Vero E6细胞,通过FBXW7过表达试验评价其对PEDV感染复制的影响,western blot检测分析结果显示,过表达FBXW7显著抑制PEDV N蛋白的表达,表明FBXW7对PEDV复制有抑制作用。进一步利用荧光定量PCR检测PEDV感染条件下过表达FBXW7对干扰素及干扰素刺激基因的影响,结果显示,与pCAGGS-HA对照组对比,pCAGGS-HA-FBXW7转染细胞IFN-β、ISG15、ISG54和ISG56的转录水平均显著提高(p<0.05),表明PEDV感染可通过下调FBXW7的表达拮抗宿主天然免疫应答促进其感染复制。本研究阐明了一种PEDV拮抗宿主天然免疫的新策略。

STAG2基因敲除的IPEC-J2细胞系构建及其对PDCoV复制影响的研究

为探究猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)中基质抗原2(STAG2)因子对猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)复制的影响,本研究针对STAG2基因设计并合成sgRNA,将其克隆至lentiCRISPR v2载体构建重组表达质粒。将重组质粒转染至IPEC-J2细胞后,利用嘌呤霉素(Puromycin)采用有限稀释法进行亚克隆,筛选STAG2基因缺失的单克隆细胞株,并经western blot鉴定后最终获得一株STAG2缺失的单克隆稳定细胞系IPEC-J2-STAG2-/-(KO)。利用western blot方法鉴定不同代次STAG2敲除细胞的遗传稳定性,结果显示,IPEC-J2-STAG2-/-细胞具有良好的遗传稳定性。为探究STAG2基因对PDCoV复制的影响,本研究将PDCoV分别感染IPEC-J2-STAG2-/-细胞和野生型IPECJ2细胞(WT),采用荧光定量PCR、western blot方法检测细胞中PDCo V N基因m RNA转录及其蛋白表达水平。结果显示,与WT组相比,IPEC-J2-STAG2-/-细胞中PDCo V N基因m RNA转录水平及其蛋白表达水平均极显著降低(P<0.01),表明STAG2缺失会抑制PDCoV在IPEC-J2细胞中的复制。为探究STAG2缺失是否刺激宿主细胞产生天然免疫应答,本研究利用荧光定量PCR方法检测敲除细胞中3种天然免疫应答相关干扰素刺激基因(ISGs)的转录水平,结果显示,与WT相比,IPEC-J2-STAG2-/-细胞内相关ISGs转录水平显著升高(P<0.01),表明STAG2缺失后宿主细胞启动天然免疫应答进而抑制PDCoV的复制。本研究首次发现STAG2基因缺失后显著上调了IPEC-J2细胞天然免疫抗病毒基因的转录水平,从而抑制PDCoV的复制,为研究PDCoV和宿主因子相互作用提供了新思路。