青霉素酰化酶(PGA)在枯草芽孢杆菌基因组上的整合表达

将巨大芽孢杆菌的青霉素酰化酶(PGA)基因整合进枯草芽孢杆菌的基因组,筛选获得可以使PGA稳定表达的枯草芽孢杆菌菌株,克服了枯草芽孢杆菌中质粒表达不稳定的缺点。分别构建了含不同PGA基因拷贝数的3种枯草芽孢杆菌菌株,同时分析了这些菌株中PGA表达量的差异。37℃试管培养36 h菌株B.subtilis/xhoI-,aprE-,vpr--的酶活力为3 U/L,菌株B.subtilis/xhoI::pga为6 U/L,菌株B.subtilis/xhoI::pga,aprE::pga为14 U/L,菌株B.subtilis/xhoI::pga,aprE::pga,vpr::pga为23 U/L。结果表明,整合的拷贝数越多,PGA的表达量越高。

枯草芽孢杆菌整合载体的构建及基因组的改造

构建了两种整合载体,分别为单交换整合载体pACC-BdbDC和双交换整合载体pDsbE,pDGC,转化野生型枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168,目的基因整合到基因组上,同时引入氯霉素抗性基因。利用FLP/frt重组系统将氯霉素抗性基因敲除,便于宿主菌的进一步改造。PCR结果表明共重新构建了6种宿主菌。复杂双交换整合载体pDGC成功将3个目的基因整合到基因组上,为多个基因同时整合提供了一种方便可行的方法。

胞外脂肪酶在枯草芽孢杆菌中的表达及其性质

枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis是一种高产的外源基因表达菌株，外源蛋白能大量分泌到细胞外培养基中。从地衣芽孢杆菌ATCC14580基因组中克隆胞外脂肪酶全基因序列，并构建枯草芽孢杆菌表达载体pACC-pUB110，得到脂肪酶基因重组载体。该表达载体有一个强启动子，经淀粉诱导能高效表达外源蛋白，以枯草芽孢杆菌胞外蛋白酶缺失型菌株WB700和野生型菌株B．subtilis168为宿主菌，得到的脂肪酶以对硝基苯棕榈酸酯为底物，测得培养基上清总活力达到76．8μ／mL。该脂肪酶在pH10-10．5表现最大水解活力，最适反应温度为37℃，在强碱条件下稳定性很好。

高中数学教学中类比思维的应用实践

类比思维是一种缜密的推理思维,在高中数学这样重要的学生逻辑思维培养阶段,将类比思维融入到高中教学与实际解题应用中来强化数学概念,能加强学生的联想能力,提高他们的类比分析思路,激发学习兴趣,深化教学内容,减少学生对于新知识的距离感。本文就简要的探讨一下类比思维的高中数学解题应用与教学实践。

高中数学教学中培养数学思维能力的实践探讨

数学思维在数学学习中占据着重要地位,其直接关系着数学能力的高低,因而在数学教学中,教师不仅要将数学知识传授给学生,而且要对学生的数学思维能力进行培养,让学生能够养成一种思维习惯,从而提高学生的数学成绩.本文主要对高中数学教学中,教师对学生数学思维的培养进行了探讨,以期能够为高中数学教学提供参考意见.

数学探究性教学之我见

探究性学习是新一轮课程改革的热门话题,改变学生被动、单一的接受学习方式,大力提倡探究性学习,是课程改革中的一个迫切的任务.本文对数学实施探究性教学进行了思考.

数学活动中增强师幼互动有效性的方法

当前幼儿园数学活动中的师幼互动存在多由教师发起、方式单一、重显性互动轻隐性互动等弊端,因此有必要从丰富教师发起的互动方式、重视回应幼儿发起的互动、注重寓师幼互动于环境创设与材料投放之中等方面入手,加强数学活动中的师幼互动,促进幼儿的数学学习。

创造性游戏中促进幼儿学习与发展的支持性策略

创造性游戏是幼儿园最基本、最经常开展的游戏,对引导和促进幼儿社会性学习与发展、培养幼儿主体独立性和创造意识具有重要意义.要提高幼儿的创造性游戏水平,教师需要根据游戏进程和幼儿的“需要共性”与“需要差异”,选择适当的时机与途径,给予不同形式的有效支持.

新时代小学班主任的角色定位

学校的学习生活是学生一生学习知识、认识世界、形成人生观和价值观的起点,对其人生发展会产生深远的影响。在这一重要时期,班主任是孩子在学校接触最频繁、密切的人,班主任的性格、思想、行为、素质会对学生产生潜移默化的影响。因此,在新时期的学校教育中,班主任所扮演的角色,不仅在原有角色的基础上提出了更高的要求,而且还从客观上增加了新的角色。所以,班主任在班级中和学生面前的角色定位必须科学而准确。本文试分析新时期下班主任的角色定位为做好班主任工作提供一定的思路。

刍议数学学具在小学数学课堂教学中的应用

小学数学具有一定的抽象性与逻辑性,学生在学习中往往会遇到较大的困难,长此以往会打击学生学习信心,不利于学生的成长发展。在传统教育模式下,教师的教学方法较为单一落后,限制了学生数学综合素养的提升。在素质教育背景下,教师应转变教学观念,创新教学方法,提升教学水平。而数学学具的运用,能够帮助学生直观理解数学知识,降低其学习的难度。文章对数学学具在小学数学课堂教学中的作用进行分析,并探究其应用策略。

甘露醇磷酸化酶基因的敲除对D-甘露醇合成的影响

为了探究甘露醇分解利用途径对甘露醇合成的影响,在重组菌株R1(K-12/pTrc99a-mdh)的基础上,通过CRISPR/Cas9 敲除E.coli PTS 系统中的cmtA、cmtB、mtlA 基因,阻断了E. coli K-12 中甘露醇的分解途径,获得了重组菌株R3(K-12/ΔcmtAΔcmtBmdh^+)和R5(K-12/ΔcmtAΔcmtBΔmtlAmdh^+)。与出发菌株R1 相比,R3 的生长速率没有降低,而R5 的生长速率明显下降。并且R5 在以甘露醇为唯一碳源的培养基上已无法生长,说明cmtA、cmtB、mtlA 三个基因全部敲除后,菌株已无法再利用甘露醇作为碳源进行生长。最后,构建的重组菌株R5,测得MDH 酶活力为258 U/mL,用高效液相色谱对胞外产物进行检测,可检测到少量的甘露醇,为进一步探究大肠杆菌合成甘露醇的调控机制奠定基础。

大班科学活动中支持幼儿多形式表达的策略探讨

幼儿园课程改革以来,科学教育活动的组织和教师指导都注重支持幼儿自主学习,让幼儿在与环境、材料和同伴多向互动中获取科学经验,发展幼儿的各种能力。《幼儿园教育指导纲要》科学领域中也要求：＂能用适当的方法表达、交流探索的过程＂;＂通过引导幼儿参与小组讨论、探索等方式,

培养小学高年级学生数学合情推理能力的实践研究

新课标将合情推理能力的培养列入了小学数学课程目标,很多学校在小学高年级的数学教学实践中要求教师根据教材内容和相关资源,通过科学的教学设计和适当的活动,引导学生观察、归纳、类比、猜想,从而得出某一结论或者是发现某些规律,培养学生的合情推理能力,以强化课程教学效果。本文主要对小学高年级数学合情推理能力培养存在的问题和优化策略进行简单的阐述和分析,希望对课程教学实践的高效化实施有所启示。

小学语文群文阅读策略浅析

小学语文群文阅读是一种新型的阅读方式,它由教师提出多个议题,并由学生在规定的时间里对几篇文章同时进行阅读,并由教师对文章进行深层次的分析。群文阅读方式的实行使学生能够同时完成几篇文章的阅读,这就很大幅度提高了学生的阅读效率。

以儿童为本建设幼儿园课程文化

儿童是独立的个体,主动的学习者和天生的创造者。教师是儿童幸福生活的引导者,是儿童天性的尊重者,是与儿童平等的对话者。因此,以儿童为本,让幼儿拥有快乐、幸福的童年是我园的使命。对于幼儿园园长来说,幼儿园课程文化的管理是幼儿园管理的核心。

园本教研中园长有效引领的实践探讨

园本教研依据的力量是教师，园长参与幼儿园的园本教研，一方面是在专业学习中进行引领，另一方面是在解决实际问题的研究中进行专业引领。要增强园长引领园本教研的有效性，就必须充分发挥园长在园本教研的组织与指导中建立机构引领、规范制度引领、理论信息引领、榜样示范引领、评价激励引领的作用，提高教师高效率解决教育教学实际问题的能力。增强园本教研的有效性。

稳定表达人有机阳离子转运体1的细胞模型构建

目的建立能稳定表达人有机阳离子转运体1(human organic cation transporter1,hOCT1)野生型及两个突变体的马丁达比狗肾上皮(Madin-Darby canine kidney,MDCK)细胞模型。方法从人肝组织中提取hOCT1野生型基因,经定点突变获得hOCT1P341L,hOCT1M420del两个突变型基因,构建表达质粒pcDNA3.1(+)-hOCT1,pcDNA3.1(+)-hOCT1P341L,pcDNA3.1(+)-hOCT1M420del。将质粒转染MDCK细胞,通过G418筛选获得抗性克隆,并通过hOCT1的荧光底物(4-二甲氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶(ASP+)筛选得到具有较高活性的MDCK-hOCT1细胞。经反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及经典底物N-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)的摄取实验,鉴定筛选得到的单克隆细胞株hOCT1 mRNA的表达及功能。结果本实验获得的hOCT1野生型及2个突变体细胞模型与转染空载体的MDCK细胞相比,其hOCT1 mRNA表达量显著增高,对经典底物MPP+的摄取为转染空载体细胞的12.5,13.7,12.0倍,hOCT1抑制剂可显著抑制细胞对MPP+的摄取。结论建立的细胞模型可用于hOCT1抑制剂及底物的筛选。

稳定表达人寡肽转运体1的细胞模型构建及应用

目的构建稳定表达人寡肽转运体1(hPepT1)的马丁-达比犬肾细胞模型(MDCK-hPepT1),并将其应用于中药单体中人寡肽转运体1抑制剂的筛选。方法构建重组质粒pcDNA3.1(+)-hPepT1,将其转染马丁-达比犬肾系细胞,经G418筛选后以有限稀释法挑选单克隆细胞。以人寡肽转运体1荧光底物β-Ala-Lys(AMCA)和经典底物Glysar对单克隆细胞转运活性进行验证;通过反转录聚合酶链式反应验证人寡肽转运体1在转录水平的表达。以中药单体对Glysar摄取的影响实现人寡肽转运体1抑制剂的筛选。结果获得的两株单克隆细胞(D19、A11)对β-Ala-Lys(AMCA)摄取均显著高于转染空载体的马丁-达比犬肾系细胞,对Glysar的摄取分别为转染空载体细胞的24、11倍;D19、A11中hPepT1的mRNA水平亦显著高于转染空载体的细胞;已知的人寡肽转运体1抑制剂(底物)显著减少单克隆细胞D19和A11对Glysar的摄取;部分中药单体对Glysar摄取产生不同程度的抑制。结论本实验成功构建了稳定高表达人寡肽转运体1的马丁-达比犬肾系细胞模型,并应用该模型筛选出对人寡肽转运体1具有潜在抑制作用的中药单体。