蚯蚓纤溶酶原激活剂的分离纯化及其性质

为了从赤子爱胜蚓中获得主要表现为纤溶酶原激活活性的蛋白酶,采用盐析、离子交换层析、凝胶过滤层析和疏水吸附层析从蚯蚓组织匀浆中纯化出6种具有纤溶活性的酶组分(F1、F2、F3、F4、F5和F6).它们均为单一多肽链;表观分子量分别为28500、29500、26100、26300、14850和32800;经非还原型SDSPAGE和扫描仪扫描,纯度分别为100%、95.2%、96.5%、93.6%、98%和97.8%;等电点(pI)均不高于3;SDSPAGE后,用Schiff试剂染色显示F5为糖蛋白;纯化的6种酶于20℃～50℃保温1h,酶活力基本不变;F1和F2、F3和F4、F5和F6分别在pH4～10、4～11、7～12范围内稳定;水解BAEE试验及纤溶活性抑制试验表明,F6既是丝氨酸蛋白酶,又是含金属离子的蛋白酶,其它5种酶为胰蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶;免疫双扩散试验结果初步表明,F1和F5以及它们和其它4种组分之间无共同的抗原决定簇;用纤维蛋白平板法及以ChromozymU和ChromozymPL为底物测定,除F1外,其余5种酶的纤溶酶原激活活性明显强于其直接纤溶活性.

焦虑、抑郁与乙肝病毒感染预后的癌基因研究

目的探讨焦虑、抑郁不良情绪与慢性乙肝发展和转归的关系。方法采用ＬＳＡＢ免疫组化和ＥＬＩＳＡ方法，检测了５２例慢性ＨＢＶ感染者肝细胞Ｃ－ｅｂｂＢ－２Ｐ１８５癌基因蛋白及血清ＨＢｅＡｇ，同时进行了ＳＡＳ和ＳＤＳ调查，结果与国内常模对照。结果Ｃ－ｅｒｂＢ－２Ｐ１８５癌基因蛋白阳性患者ＳＡＳ和ＳＤＳ总标准分均值Ｘ分别为４４．２１０±６．１２和４９．１３±９．８７，分数升高与国内常模之间有显著差异，（Ｐ＜０．０１）。结论提示焦虑、抑郁情绪在慢性乙肝的发生发展中可能起重要作用。

蔗糖梯度离心法纯化Vero细胞乙脑疫苗的纯度分析及与层析法的比较

通过对蔗糖梯度离心法纯化Vero细胞乙脑疫苗的纯化工艺进行分析,发现现行工艺中收取的病毒组分中,不同蔗糖浓度中病毒的纯度是不同的,而呈峰型且与病毒效力峰及蛋白浓度峰不重合。实验结果对今后工艺的改进具有指导意义。另外应用Sephacry1s1000凝胶层析法对乙脑病毒进行了纯化研究和分析,发现蔗糖梯度离心法和层析法纯化的病毒的纯度及回收率分别为291.46u/mg、96.01%和309.41u/mg65.08%,Sephacry1s1000凝胶层析法同样可以获得较高的纯度和收率。

一种新型蚯蚓纤溶酶组分的部分性质研究

目的获得一种高效的溶栓药物。方法从赤子爱胜蚓 (Eiseniafoelida)中共提取 6种纤溶酶组分 ,分别命名为F1～F6。取F1用Lowry法测定蛋白质浓度 ,SDS PAGE鉴定纯度及表观相对分子质量 (Mr) ,纤维蛋白平板法测定其纤溶活性 ,测定其水解BAEE(Nα 苯甲酰 L 精氨酸乙酯盐酸盐 )、血浆纤溶酶特异性底物ChromozymPL(苄氧羰酰甘氨酰脯氨酰精氨酰对硝基苯胺盐酸盐 )及组织型纤溶酶原激活剂Chromozymt PA(N 甲磺酰苯丙酰甘氨酰精氨酰对硝基苯胺盐酸盐 )的活性 ,并进行N端氨基酸序列测定。结果F1纯度为 10 0 % ,表观Mr 为 2 85 0 0 ,总纤溶活性为 6 5 .5 1× 10 3 mm2 /mg ,水解BAEE的米氏常数 (Km)为 2 .80 87× 10 -2 mol/L。对chromozymPL及chromozymt PA的亲和力较低。F1的N端氨基酸序列为IIGGSNASPGEFPWQ ,且对天然凝血块有较强的溶解作用。结论F1为纯度很高的单一组分 ,纤溶活性较高。

一种新型蚯蚓纤溶酶的部分性质研究

为获得一种高效的溶栓药物。从赤子爱胜蚓(Eiseniafoelida)中分离纯化得到了一种纤溶酶组分。用Lowry法测定蛋白质浓度,SDSPAGE鉴定纯度为98%,表观相对分子质量(Mr)为14850,纤维蛋白平板法测定其总纤溶活性为65.51×103mm2/mg,直接纤溶活性为15.61×103mm2/mg,间接纤溶活性为26.34×103mm2/mg。水解BAEE的米氏常数(Km)为1.82×105mol/L。水解ChromozymPL的米氏常数(Km)3.98×105mol/L,水解ChromozymtPA的米氏常数(Km)5.55×105mol/L活性,N端氨基酸序列测定的结果为VIGGTNAIPGEFPYQ。结果表明该纤溶酶分子量较小,间接活性较高,适宜作为一种新型的溶栓药物。

CEA的表达与食管癌预后的关系

目的 为临床预测食管癌的转归和预后提供客观病理学指标。方法 采用免疫组化法 ,用CEA单克隆抗体检测食管癌中CEA蛋白的表达。结果 91例食管癌CEA阳性率为 49 45 % ,长期存活组阳性率为 35 7%明显低于两年内死亡组的6 1 2 % ,两组差异显著 (P <0 0 5 ) ;CEA弥漫性着色并浆着色者预后差 ,长期存活率低 ,且与淋巴结转移高度相关 (P <0 0 5 )。结论 CEA表达阳性预后较差 ,术后长期生存率较低 ,且肿瘤组织CEA染色由膜到浆 ,由局限到弥漫 ,为肿瘤进展恶化的标志。

nm23-H_1、CerbB-2的表达与食管癌预后的关系

用免疫组化的方法分析 91例食管癌 (鳞癌 84例 ,腺癌 3例 ,未分化癌 4例 )转移抑制基因 ( nm2 3)和癌基因 Cerb B- 2蛋白表达与肿瘤临床、病理各指标间的关系 ,探讨其在食管癌发生中的相互关系和影响。结果显示 :转移抑制基因 nm2 3- H1 和原癌基因 Cerb B- 2染色均定位于细胞浆 ,两者均与淋巴结转移、预后有显著相关性 ,两者表达无相关关系。在无淋巴结转移组 ,Cerb B- 2蛋白表达亦和预后有显著负相关。认为 nm2 3- H1 高表达或 Cerb B- 2低表达者 ,淋巴结转移率低 ,术后生存率高 ,预后较好 ;Cerb B- 2可作为一个独立的预后指标 ,无论有无淋巴结转移 ,Cerb B-

PCNA、C-erbB-2P^(185)在 HBV 感染慢性肝炎 LC、HCC 中表达的对照研究

对１４６例慢性乙型肝炎、肝硬变和肝细胞癌标本作了免疫组化染色，观察其Ｃ－ｅｒｂＢ－２Ｐ１８５、增殖细胞核抗原的表达情况，探讨他们在ＨＢＶ诱发ＨＣＣ过程中的作用和意义。结果表明：（１）在ＨＢＶ感染的慢性肝炎阶段已出现Ｃ－ｅｒｂＢ－２Ｐ１８５和ＰＣＮＡ的异常表达，总阳性率分别为８７％和８１％。（２）由慢性乙肝、肝硬变向肝细胞癌发展过程中，出现了增殖细胞核抗原表达逐渐升高，Ｃ－ｅｒｂＢ－２Ｐ１８５逐渐下降的趋势。（３）本实验还证实Ｃ－ｅｒｂＢ－２Ｐ１８５与肝病理炎症程度密切相关，而增殖细胞核抗原主要反映细胞增殖状态。由此可见，ＨＢＶ致肝细胞癌过程是一个早期以炎症为主，逐渐过度为细胞增殖为主的多阶段复杂过程。

增殖细胞核抗原和c-erbB-2癌基因蛋白在乙肝病毒感染慢性肝病中表达的意义

对１４６例慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌标本作了免疫组化染色，观察其ｃ－ｅｒｂＢ－２癌基因蛋白（Ｐ１８５）及增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）的表达情况，探讨他们在ＨＢＶ诱发ＨＣＣ过程中的作用和意义。结果：（１）在ＨＢＶ感染的慢性肝炎阶段已出现ｃ－ｅｒｂＢ－２Ｐ１８５和ＰＣＮＡ的异常表达，总阳性率分别为８７％和８．１％；（２）由慢性乙肝、肝硬化向肝细胞癌发展过程中，出现了ＰＣＮＡ表达逐渐升高，ｃ－ｅｒｂＢ－２Ｐ１８５逐渐下降的趋势：（３）证实了ｃ－ｅｒｂＢ－２１８５与肝病理炎症程度密切相关，而ＰＣＮＡ主要反映细胞增殖状态。由此可见，ＨＢＶ致ＨＣＣ过程是一个早以炎症为主，逐渐过度为细胞增殖为主的多阶段复杂过程。

慢性HBV感染癌基因蛋白表达与HBeAg的关系

目的:为阐明癌基因蛋白异常表达与HBV复制的关系.方法:用LSAB免疫组化和ELISA方法,检测了64例慢性HBV感染者肝细胞 C-erbB-2 P185、rasP^21、P^53癌基因蛋白和血清HBeAg_o结果:结果显示:C-erbB-2 P185和ras P^21阳性组血清HBeAg检出率分别为89.4%和84.6%,C-erbB-2P185、ras P^21阴性组 HBeAg检出率为20%和48%,两组差异显著.结论:表明癌基因蛋白c-erbB-2 P185和ras P^21的异常表达与 HBV复制密切相关.

隐原性致纤维化肺泡炎29例

隐原性致纤维化肺泡炎(CFA)是一种进展快、预后不良的肺病,临床上并非罕见.我们自1982～1990年共收治47例,现就其中资料较完整者29例分析如下.临床资料1、一般情况:29例均依据1981年日本厚生省特种疾病调研组织CFA诊断标准进行诊断.其中11例经纤支镜肺活检、5例经纤支镜代胸腔镜肺活检、2例经尸检证实.29 例中男17例,女12例,年龄13～78岁.平均50.3岁.急性型 3例,慢性型26例.病程3月～10年,平均3.6年.

抗Ⅰ型脊髓灰质炎病毒单克隆抗体的制备

目的制备抗脊髓灰质炎病毒单克隆抗体,为ELISA检测方法的建立奠定基础。方法将Ⅰ型脊髓灰质炎减毒疫苗原液和灭活疫苗原液经超滤、超离纯化,以纯化的减毒脊髓灰质炎病毒D抗原免疫BALB/c小鼠,得到的脾细胞与SP2/0-A14小鼠骨髓瘤细胞融合,以纯化的灭活脊髓灰质炎病毒D抗原建立间接ELISA法,筛选分泌特异性单抗的阳性细胞株,诱生小鼠腹水,通过正辛酸-硫酸铵法纯化抗体,并进行各项鉴定。结果获得两株稳定分泌抗脊髓灰质炎病毒单抗的细胞株7G5及5E4。纯化的7G5和5E4株单抗分别可与脊髓灰质炎病毒D抗原的VP2、VP3衣壳蛋白结合;在不同温度下放置均比较稳定;pH4不利于7G5株单抗的保存;5E4株单抗的相对亲和力大于7G5株;7G5株单抗的亚类为IgM,5E4株单抗的亚类为IgG2a;两株单抗可识别相似表位;7G5株和5E4株单抗的中和效价分别为1:64和1:128。结论已成功制备了两株分泌抗脊髓灰质炎病毒的单抗。

酶联免疫吸附试验定量检测人抗流行性乙型脑炎病毒IgG抗体方法的研究

为建立快速检测人抗流行性乙型脑炎 (乙脑 )病毒抗体的方法 ,用纯化乙脑病毒选择实验条件 ,通过与蚀斑减少中和试验 (PRNT)的比较 ,确定保护性抗体的酶联免疫吸附试验 (ELISA)的尺度 ,再对两种方法进行比较。结果 :ELISA比PRNT法灵敏度高 16～ 32倍。两种方法有良好的线性关系 (r=0 771,P<0 0 0 1)。PRNT法 1∶10抗体滴度对应的ELISA结果为 0 331U ,两种方法差异无显著的统计学意义 (χ2 =0 14 2 ,P >0 0 5 ) ,总符合率为 81 3%。

慢性乙型肝炎病毒感染患者焦虑、抑郁与C-erbB-2P185癌基因蛋白表达

目的探讨焦虑、抑郁不良情绪与慢性乙型肝炎发展和转归的关系。方法采用ＬＳＡＢ免疫组化和ＥＬＩＳＡ方法，检测５２例慢性乙型肝炎病毒感染者的肝细胞ＣｅｒｂＢ２Ｐ１８５癌基因蛋白及血清ＨＢｅＡｇ，同时进行焦虑自评量表（ＳＡＳ）和抑郁自评量表（ＳＤＳ）调查，并与国内常模对照。结果显示ＣｅｒｂＢ２Ｐ１８５癌基因蛋白阳性患者ＳＡＳ和ＳＤＳ总标准分均值升高，分别为４４±６和４９±１０，并差异有非常显著性，（Ｐ＜０．０１）。结论提示焦虑、抑郁情绪可能对慢性乙型肝炎的发生、发展起作用。

乙型肝炎免疫复合物检测方法的建立和优化

目的建立和优化直接检测乙肝免疫复合物（IC）的方法。方法建立补体Clq固相ELISA、鼠抗-HBs固相ELISA、补体消耗试验等三种检测乙肝IC的方法，并对试验条件进行优化。结果三种方法均可检测出乙肝IC，都有较高灵敏度和重复性。结论选择鼠抗-HBs固相ELISA作为直接检测乙肝IC的最佳方法。

c-erbB-2 p185癌蛋白与慢性乙型肝炎肝组织免疫损伤的关系

应用 SLAB 免疫组织化学方法,针对 c-erbB-2 p185癌基因蛋白与慢性乙型肝炎肝组织免疫损伤的关系,在以下方面进行了初步探索。资料与方法1.资料115例 HBV 感染半年以上患者,男86例,女29例,大多年龄20～35岁(占58.3%),全部经肝病理组织学诊断,计慢性迁延性肝炎(CPH)65例,慢性活动性肝炎(CAH)41例,未见明显肝组织异常及仅表现轻微非特异肝组织改变(ASC)9例。以血清HBsAg 和肝组织 HBV DNA 阳性的肝细胞癌55份、肝硬化29份及血清 HBV 指标阴性的正常肝组织6份为对照标本。2.方法所有肝穿标本经10%甲醛固定,石蜡包埋,作连续切片,厚4～5μm。分别作 HE 和免疫组织化学染色。

重组酵母表达HBsAgP24亚基结合程度对抗原性的影响

目的观察HBsAg P24亚基结合紧密程度对其抗原性的影响。方法3批重组酵母表达纯化的P24亚基松弛结合型HBsAg经半转型和转型处理后，成为混合和紧密结合型HBsAg，用HPLC法检测P24亚基结合紧密程度，松弛型和紧密型HBsAg免疫小鼠后，检测NK细胞杀伤活性及抗原特异性脾淋巴细胞增殖活性。将HBsAg吸附于佐剂Al（OH）3凝胶，免疫小鼠后用半数有效剂量法（ED50）检测所诱导的体液免疫应答，用体外相对效力法（RP）检测抗原的反应原性。结果3批松弛型、混合型和紧密型共9组HBsAg P24亚基紧密结合型比率分别在23．00％～32．00％、38．43％～50．98％和39．65％～52．76％之间，混合型组P24亚基紧密结合程度接近紧密型组；3批紧密型HBsAg免疫小鼠后可比松弛型HBsAg诱导更强的NK细胞活性，松弛型HBsAg免后4周内诱导抗原特异性脾淋巴细胞活性高于紧密型HBsAg，但总体上HBsAg仅诱导较弱的特异性脾淋巴细胞应答；紧密型HBsAg组比松弛型组诱导较强的体液免疫应答，1批混合型抗原体液免疫应答低于同批松弛型和紧密型组，2批松弛型组和其同批紧密型组的体液免疫应答程度接近；混合型HBsAg RP平均值显着高于松弛型组（P〈0．01），紧密型组RP平均值小于混合型组。结论重组酵母表达P24亚基结合程度不同的HBsAg均保持一定程度的抗原性。紧密型HBsAg免疫可诱导较强的非特异性NK细胞和体液免疫应答，混合型HBsAg的免疫反应原性较高。

脊髓灰质炎灭活疫苗抗原含量检测方法的研究进展

脊髓灰质炎灭活疫苗（inactived poliovirus vaccine, IPV）的问世使全球范围内消灭脊髓灰质炎成为可能，而且IPV在全球致力于消灭脊髓灰质炎中的作用日益增强。通过IPVD抗原检测可以检测IPV效力，因此IPVD抗原的快速定量检测成为亟待解决的关键问题。目前，最常用的体外检测法是ELISA法，然而，尚无国际公认的标准IPV效力检测法。此文就IPV抗原含量检测方法的研究进展加以综述。

美国生物制品生产变更管理的研究及其对我国的启示

在药品生产过程中，生产企业经常会对已上市生物制品的工艺、设备、设施、质量控制等进行变更。由于生物制品具有特殊性以及生产变更对其安全性和／或有效性的潜在影响较大，因此美国FDA对生物制品生产变更的管理要比一般药品严格。美国法律法规和指南已对部分生物制品的生产变更（chemistry，manufacturing，andcontrols，CMC，即化学、制造和控制）做出了明确规定，并且此类规定适用于包括委托生产地点（contract locations）在内的所有生产地点。

我国实施血液制品上市许可持有人制度的挑战及建议

基于《药品上市许可持有人制度试点方案》,探讨我国血液制品的管理挑战与实施上市许可持有人制度的建议。通过明确我国血液制品管理制度的各限制性规定,分析血液制品行业现状,进而对美国血液制品的委托生产制度进行研究,分析其对我国血液制品委托生产的借鉴之处。我国可借鉴美国生物制品委托生产的规定,基于"风险评估"理念将委托生产的等级划分为重大变更、中等变更、微小变更,设置相应的申报通道,并在相应的指导原则中列举上市后可能出现的各种事项。通过对不同等级的审核,加强对高风险生产场地的监管,及时评估委托生产的风险程度,减小对较低风险等级的委托生产的监管力度,从而减轻相关监管机构以及企业的负担,促进我国血液制品上市许可持有人制度的顺利实施。