人用狂犬病疫苗pH值质量分析

目的:了解人用狂犬病疫苗pH值质控现状,为做好人用狂犬病疫苗质量评价提供数据支持。方法:采用《中华人民共和国药典》三部pH值测定法,对国内15家企业人用狂犬病疫苗进行测定,每批疫苗测3次;对测得的结果进行趋势分析;并对人用狂犬病疫苗pH值质量控制进行讨论。结果与结论:测定结果显示,有14家企业的42批疫苗pH值在7.41~7.63,1家企业3批疫苗pH值在7.68~7.73;15家企业45批疫苗pH平均值为7.51,均在7.2~8.0的合格范围。不同病毒类疫苗的pH值标准各不相同,但对狂犬病毒而言,pH值在7.2~8.0之间能保持较好的生物学活性,因此适宜的pH值对维持狂犬病疫苗的安全、有效至关重要。

狂犬病疫苗效价测定改良NIH法建立及应用

目的按照动物试验3R原则,建立改良NIH法(modified NIH,M-NIH)即单一稀释法检测狂犬病疫苗效价,替代传统的NIH法。方法通过比较单一稀释度的待检疫苗与第八批狂犬病疫苗效力试验用国家标准品的小鼠保护率,建立狂犬病疫苗效价测定的改良NIH法,并对该方法进行重复性、准确性及适用性验证。采用M-NIH法和NIH法对52批狂犬病疫苗进行比较研究,再联合9家实验室验证共计247批次,使用Kappa系数和Mcnemar-Bowker检验评价两种方法的一致性。并采用3家企业生产的狂犬病疫苗,进行适用性验证。对M-NIH法获批准后近4年来应用于狂犬病疫苗批签发检验做回顾性分析。结果52批次狂犬病疫苗效价测定的两种方法比较研究结果显示,两种方法的符合率为92.3%(Kappa=0.82,P<0.01);247批次扩大验证结果表明两种方法的符合率为80.2%(Kappa=0.54,P<0.01)。采用M-NIH法测定标准品保护率时,实验室内变异系数为21.7%,实验室间变异系数为23.4%。3家企业批签发狂犬病疫苗适用性验证结果表明M-NIH重复性检测结果与NIH结果符合率为100%。近4年来批签发机构采用M-NIH法抽检820批狂犬病疫苗效价,合格率为93.8%;M-NIH不合格批次最终经NIH法测定后,合格率合计为99.8%。结论建立了改良NIH法。该方法获得批准后用于狂犬病疫苗的效价检测,大大减少了动物使用量,提高了狂犬病疫苗的批签发效率。

Vero细胞在人用狂犬病疫苗中的研究和应用进展

Vero细胞是WHO认可的疫苗生产用细胞,已成为全世界疫苗生产推荐的细胞基质。因其易于生长、可在微载体的发酵罐中大规模扩增、可模式化培养且在限定代次内细胞性状比较稳定的特点,受到疫苗研发与生产工作者的青睐。Vero细胞正式用于人用狂犬病疫苗的生产也有40多年的时间,对狂犬病疫苗的推广使用和狂犬病的预防发挥了重要的作用。本文旨对Vero细胞在人用狂犬病疫苗中的研究和应用进行总结回顾。

狂犬病mRNA疫苗的应用和研究进展

狂犬病是一个古老而又传统的疾病,其公共安全威胁持续存在,人类需要新型、快速和价格更为低廉的疫苗技术对其进行防治.mRNA疫苗作为一种新型的核酸疫苗,在感染性疾病的预防控制和癌症的治疗等领域已经取得阶段性进展,因此狂犬病mRNA疫苗有望成为抗击狂犬病的新生力量.本文将从狂犬病mRNA疫苗的结构、递送系统和临床前及临床研究等方面进行简要综述,阐明狂犬病mRNA疫苗目前的研究现状.

狂犬病口服疫苗对消除人间狂犬病的重要作用

狂犬病严重威胁人类生命,控制狂犬病需要从病毒的源头着手。在狂犬病毒的多种宿主中,犬科动物所占比例最大。因此,消除狂犬病的关键是对犬的免疫覆盖率达到70%以上。事实证明,通过注射灭活疫苗对犬只形成免疫屏障是一件困难的事情。采用口服疫苗策略控制野生动物狂犬病的成功案例给大家提供了新的思路,因此世界卫生组织建议采用狂犬病口服疫苗对犬进行免疫,用以提高犬只的免疫覆盖率,从而达到2030年消除和控制狂犬病的目的。

1株狂犬病毒减毒株的毒力和分子特性研究

目的对实验室研发的1株狂犬病减毒株CTN181-3的致病性和基因型特性进行研究。方法用小鼠脑内、口腔接种法和金黄地鼠口腔接种法测定病毒毒力。将病毒通过乳鼠脑内、豚鼠颌下腺和细胞连续传多代,测定传代后病毒的遗传稳定性。对CTN181-3进行全基因组测序,并与其亲本株进行对比分析。结果CTN181-3对实验动物毒力高度减弱,对3周龄小鼠无论脑内或口腔接种均无致病性,对2周龄小鼠也表现出脑内低毒力;口腔接种8周龄金黄地鼠亦无发病死亡。遗传稳定性方面,经1~3 d龄乳鼠脑内连续传5代或豚鼠颌下腺传4代,传代增殖后的病毒滴度虽高达7.10 lg PFU/mL或7.63 lg PFU/mL,对小鼠脑内接种仍保留无致病力的弱毒特性;在BSR细胞和Vero细胞上分别传10代,表型特性稳定。全基因组测序结果分析显示CTN181-3株与国内近年来分离株的同源性高于其他疫苗株与国内分离株的同源性。CTN181-3株与其原始的亲本株CTN-1比较,发生8个氨基酸位点的突变,其中G276 L→V和L1496 M→W氨基酸的突变在CTN181株未发生,为CTN181-3株所特有。因此,这2个位点的氨基酸突变应该是CTN181-3株比CTN181株毒力更弱、遗传稳定性更高的分子基础。结论CTN181-3株的神经毒力高度减弱,毒力稳定,是一种很有应用前景的动物用狂犬病候选疫苗株。

减毒狂犬病病毒CTN181-3株免疫学特性研究

目的对本室研发的1株狂犬病减毒株CTN181-3的免疫学特性进行研究。方法以小鼠和金黄地鼠为模型,口腔或肌肉免疫1次后考查暴露前免疫;以金黄地鼠为模型,肌肉免疫考查暴露后免疫。结果CTN181-3株经小鼠和金黄地鼠分别口腔或肌肉免疫1次均能产生高滴度的中和抗体和良好的攻击保护效果;经小鼠口腔和肌肉免疫早期即开始产生细胞因子IFN-γ和IL-2,诱发有效的细胞免疫。以金黄地鼠为模型的暴露后免疫结果显示:肌肉免疫1次的保护率为50%,而免疫2次的保护率可达100%。结论CTN181-3株具有良好的体液免疫和细胞免疫保护效果,而且暴露后2次免疫不必接种免疫球蛋白即可达到100%有效保护,其免疫性强、保护效果好,是一种很有应用前景的狂犬病动物用候选疫苗株。

狂犬病两株不同毒力克隆株病毒的神经毒力和全长基因序列比较

目的对2株毒力不同的狂犬病病毒克隆株(CTN181-3和CTN181-12)进行神经毒力和全长基因序列的比较。方法分别对2株病毒用10、14和21日龄小鼠脑内接种,测定小鼠的致死力(LD_(50));同时用空斑法测定2株病毒的病毒滴度(PFU),以lgPFU/lgLD_(50)比较2株病毒的毒力差异;分别对2株病毒进行全基因序列测定并分析,找出毒力差异关键基因位点。结果 2株病毒对10、14和21日龄小鼠的lgPFU/lgLD_(50),CTN181-3株为0.07、3.40和6.60,CTN181-12株为<-0.9、<-0.6和1.04。全基因序列分析表明,二者共有8个核苷酸和6个位点的氨基酸存在差异。结论 CTN181-3株的神经毒力明显低于CTN181-12株,两者间6个氨基酸的差异是其毒力差异的分子基础。

人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)基质残余蛋白标准品的建立

目的:研制用于人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)中地鼠肾细胞蛋白质残留量检测(ELISA法)的国家标准品。方法:分两步进行协作标定和量值溯源,第一步采用Lowry法对原代地鼠肾细胞蛋白质标准品原液进行赋值,第二步采用ELISA法对原代地鼠肾细胞蛋白质标准品进行赋值。结果:数据经统计学处理结果,最终原代地鼠肾细胞蛋白质标准品量值为4.0μg·mL^(-1),95%可信限为:(4.0±0.5)μg·mL^(-1)。结论:建立了国家原代地鼠肾细胞蛋白质标准品,赋值准确可靠、科学严谨,可用于人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)基质残余蛋白的质量控制。

中国狂犬病口服疫苗的研究进展及其应用的紧迫性

中国科学家早在上世纪80年代开始研究狂犬病动物口服疫苗,获得数株毒力减弱的疫苗株,并进行过犬的口服免疫实验和大规模安全性和保护效果的现场观察。其中有几株减毒株的弱毒特征、遗传稳定性和免疫性与WHO认可并广泛应用的动物口服疫苗毒种相似。消除狂犬病的关键措施是对犬进行大面积免疫达到免疫覆盖率70%以上,中国犬的数量多达亿头,而且多数为散养犬,以常规的注射免疫很难达到这个水平。对犬实施口服免疫提高免疫率也是WHO和狂犬病专家积亟提倡和推荐的。中国已有多株减毒株,国家应充分发挥它们的作用,在人力、物力、财政上予以大力支持,完善这些候选株以便尽快得到批准应用,从而达到全球2030年消除人间狂犬病的目标。

中国人用狂犬病疫苗百年发展

自1885年法国人巴斯德发明狂犬病疫苗之后约30年,人用狂犬病疫苗才被引入中国。从20世纪20年代开始,中国人用狂犬病疫苗历经动物脑组织疫苗、佐剂地鼠肾细胞疫苗、浓缩佐剂地鼠肾细胞疫苗、浓缩纯化佐剂地鼠肾细胞疫苗、浓缩纯化无佐剂地鼠肾细胞疫苗、Vero细胞疫苗和人二倍体细胞疫苗等发展历程,生产工艺才逐步成熟、稳定。从百年前年产量20~50人份到2022年年产量2 000万人份,中国已跃升为人用狂犬病疫苗的生产和使用大国。经过近百年的努力,中国人群狂犬病的发病率降到0.011 1/10万,人用狂犬病疫苗的接种功不可没。人用狂犬病疫苗在中国的百年发展史,也是中国生物制品百年发展的缩影。

第九批狂犬病疫苗效力检定用国家标准品的制备和质量研究

目的 制备第九批狂犬病疫苗效力检定用国家标准品,并进行质量研究。方法 按照《中华人民共和国药典》2015版(三部)(简称《中国药典》)中关于国家药品标准品制备的相关要求,采用生物反应器工艺,以Vero细胞为基质培养狂犬病病毒CTN-1V疫苗株,经收获、超滤浓缩、病毒灭活和水解后,层析柱纯化得到疫苗原液。采用ELSIA对原液中的糖蛋白抗原含量进行测定,以终浓度为3.0%的人血清白蛋白为稳定剂,并按原液糖蛋白抗原含量7.0 EU/mL进行半成品配制,之后按1.0 mL/支规格进行无菌分装,采用2台冻干机冻干,批号分别为201906001-01、201906001-02,对分装冻干候选标准品的外观、分装精度和均匀性进行检查。并依据《中国药典》中冻干人用狂犬病疫苗制品相关标准分别对单次收获液、疫苗原液和冻干标准品的无菌检查等项目进行了检定。结果 单次病毒收获液、原液质量均符合要求,该批原液中糖蛋白抗原含量为25.9 EU/mL。标准品冻干成品外观、分装精度和均匀性均符合标准物质的要求。另外,该2批候选标准品的渗透压、pH、水分等项目均符合《中国药典》的相关要求。结论 本研究制备的候选标准品各项质量检测指标均符合《中国药典》的各项要求,分装精度和均匀性良好,可在完成效价值的协作标定并经批准后作为第九批狂犬病疫苗国家标准品使用。

原子吸收分光光度计光栅位置改变的应急处理

原子吸收分光光度计固定光栅位置的两个螺丝松动,使光栅起始位置发生变化,引起光栅转角改变,导致波长变化,波长误差变化的现象为:短波波长误差为正,长波波长误差为负;或者是短波波长误差为负,长波波长误差为正.遇此情况,一般是请专业人员调整后才能使用.若一时请不到专业人员而又急于使用,一般多采用在某种元素的灵敏线理论波长(λ理)附近寻找发射强度较大的谱线,并通过测定该元素标准溶液的吸收来确定其是否为该元素的灵敏线.这种方法对于灵敏线附近存在着非吸收线的元素是非常紧琐的,特别是在灵敏线附近存在多条非常靠近的特征谱线的元素,如:Cr357.90nm,359.35nm,360.53nm;Mn279.50nm,279.83nm,280.

火焰原子吸收法直接测定酒中锰

[目的]寻求一种快捷、简便、准确测定酒中锰的新方法。[方法]首先用乙醇和水把酒样勾兑成酒精度相同、稀释倍数也相同的试液，然后采用火焰原子吸收法直接测定酒中锰。[结果]方法的检出限为0．003mg／L；标准偏差〈0．0013mg／L；RSD〈1.3％；样品加标川收率为89．6％～100．3％。[结论]酒样经勾兑后采用火焰原子吸收法直接测定酒中锰，方法快捷、简便、精密度与准确均符合微量分析要求。

第九批人用狂犬病疫苗国家标准品的协作标定

目的对制备的第九批候选人用狂犬病疫苗国家标准品的效价进行协作标定,并最终赋值。方法组织人用狂犬病疫苗生产、研发等有资质的实验室,以第七批狂犬病疫苗国际标准品(NIBSC代码:16/204)为检测标准品,采用NIH法对候选狂犬病疫苗国家标准品进行效价测定。对协作标定单位的检测结果进行统计学分析,取有效检测值的几何均值作为候选标准品的最终效价值。根据国家药品标准物质制备的要求,对该候选标准品进行热加速破坏后检测糖蛋白抗原,考察其稳定性。结果参加协作标定的单位有20家,剔除未严格按照协作标定SOP操作的2家,剩余协作单位数据均有效,经统计学分析,第九批狂犬病疫苗国家标准品效价最终赋值为11.4 IU/mL,95%可信限为10.9~11.9 IU/mL,ED_(50)的95%参考范围为2.10~2.75。37℃放置不同时间(2、4、8和16周)糖蛋白抗原检测结果未见明显差异。结论完成了第九批候选人用狂犬病疫苗国家标准品(批号:201906001)的协作标定,其效价赋值科学、严谨、数据可靠,热稳定性符合要求。目前该标准品已获得国家药品标准物质委员会批准使用,对人用狂犬病疫苗的质量控制,尤其是有效性的质控具有重要意义。

人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)的免疫原性评价

目的研究狂犬病病毒aG株生产的人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)免疫接种后抗体动态水平,评价疫苗的免疫原性,并对企业A和企业B生产的狂犬病疫苗进行效力评价。方法采用企业A和B生产的人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)(简称狂苗)按暴露后免疫程序接种受试者,分别于免疫前、第1针免疫后3、7、14、42 d抽血并分离血清,用快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)检测中和抗体滴度,比较2组受试者血清样本的抗体阳转率和抗狂犬病中和抗体滴度;并对2015年1月至2023年3月企业A和企业B申报批签发的狂苗抽检效价结果进行回顾性分析,效力检测采用《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)2020版(三部)人用狂犬病疫苗效价测定法。结果企业A和企业B生产的狂苗第1针免疫后7 d抗体阳转率分别为50.6%、51.5%,14、42 d阳转率均为100%,抗体阳转率差异无统计学意义(χ^(2)=0.0161,P=0.899);第1针免后7 d中和抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)分别为1.5、2.2 IU/mL,差异无统计学意义(t=0.316,P=0.752);第1针免后14 d的GMT分别为5.7、8.7 IU/mL,差异无统计学意义(t=0.864,P=0.388);第1针免后42 d的GMT分别为9.7、9.8 IU/mL,差异无统计学意义(t=0.092,P=0.925)。参照《中国药典》2015版附录3503和《中国药典》2020版附录3503第一法(NIH法)检测的企业A和企业B的疫苗效价几何均值分别为6.8和6.0 IU/剂,差异无统计学意义(t=1.699,P=0.094)。参照《中国药典》2020版附录3503第二法(改良NIH法)检测的企业A和企业B生产的狂苗效价均≥4.0 IU/剂。结论2家企业利用狂犬病病毒aG株在原代地鼠肾细胞上生产的狂苗均可以及时地在人体内诱导产生保护性抗体,回顾分析表明效价检测结果全部符合规定,疫苗具有良好的免疫原性。

中国狂犬病疫苗生产株CTN-1全基因序列分析

本文首次对我国现行狂犬病疫苗生产用毒株CTN-1进行全长基因组序列测定和分析,为CTN-1疫苗在我国实际应用中的优势提供理论基础。利用RT-PCR方法分段扩增CTN-1全基因组序列,随后将PCR产物克隆到T载体、测序、拼接,用MegAlign软件比较CTN-1全基因组序列与国内外狂犬病疫苗株和街毒株全基因组序列的同源性;再以糖蛋白(G)基因为模板,用ClustalX和MEGA4软件进行系统进化分析。测序结果表明CTN-1全基因组序列的长度为11925nt(GenBank登录号FJ959397),序列分析表明CTN-1为基因Ⅰ型;CTN-1株全基因组序列与国内外狂犬病疫苗株和街毒株全基因组之间的同源性是81.5%～93.4%;与美国蝙蝠分离株SHBRV18的同源性最低,仅为81.5%;与新近从中国国内分离的野毒株HN10株的同源性最高,达93.4%。系统进化分析结果表明,CTN-1与国内不同地区大多数分离的狂犬病街毒株聚类于同一组内;而我国另一疫苗株aG株与国外疫苗株如Flury、PM、PV、ERA、RC-HL和个别中国街毒株分在另一组内。G基因氨基酸对比也显示CTN-1株与国内大多数街毒株的同源性高于其他疫苗株,结果说明CTN-1株较其他疫苗株病毒更适合制备用于预防中国狂犬病的灭活疫苗。

一株狂犬病病毒减毒株CTN-181的表型特性研究

目的全面了解狂犬病病毒减毒株CTN-181的表型特征,并与其亲本株CTN-1进行比较。方法将CTN-181株病毒在BHK21细胞中培养,观察其细胞病变和空斑形成特性;用细胞培养的病毒以脑内、肌内和口腔的方式接种不同周龄的小白鼠,同时脑内接种家兔和豚鼠,以同法接种其亲本株CTN-1进行毒力比较。另外,将病毒在BHK21细胞连续传10代,在乳鼠脑内传3代观察其弱毒特性的稳定性。结果 CTN-181株在BHK21细胞上培养出现较CTN-1株明显的细胞病变、较高的空斑滴度。CTN-181株对家兔、豚鼠脑内接种不致病,对4周龄以上的小鼠任何途径接种均不致病,而其亲本株CTN-1株对这些动物均致病或致死。CTN-181株通过细胞传10代和乳鼠脑内传3代后减弱的毒力未回升,无弱毒返祖现象。结论 CTN-181是一株减弱且稳定的减毒株,其弱毒的表型特征与WHO推荐用于制备动物和犬的口服疫苗株SAG2相似。