丹酚酸F调控Bax/Caspase-3/GSDME信号通路改善肾小管上皮细胞焦亡作用机制

目的:基于B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)/胱天蛋白酶-3(Caspase-3)/消皮素E(GSDME)通路探讨丹酚酸F改善高糖诱导的肾小管上皮细胞(HK-2)损伤的机制。方法:细胞增殖与活性检测(CCK-8)法检测不同浓度(2.5、5、10、20μmol·L^(-1))丹酚酸F对高糖诱导的HK-2细胞相对活力的影响及给予丹酚酸F不同干预时间条件下HK-2细胞的相对活力;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒和酶联免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒分别检测细胞培养基上清中LDH和白细胞介素-1β(IL-1β)的含量;流式细胞术结合异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)和Hoechst 33342/PI染色检测丹酚酸F对高糖诱导的HK-2细胞PI阳性率的影响;蛋白免疫印迹法(Western blot)评价丹酚酸F对高糖诱导的HK-2细胞中Bax、Bcl-2、细胞色素C(Cyt C)、胱天蛋白酶-9(Caspase-9)、Caspase-3、GSDME蛋白表达及激活情况的影响。2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯荧光探针法(DCFH-DA)及线粒体膜电位(JC-1)考察丹酚酸F对高糖诱导的HK-2细胞中活性氧(ROS)产生及线粒体膜电位的影响。结果:与空白组比较,模型组细胞活力显著降低(P<0.01),乳酸脱氢酶、炎症因子IL-1β、PI阳性细胞比例均显著升高(P<0.01);Bax、Cyt C、Caspase-9、Caspase-3、GSDME蛋白表达显著升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.01),HK-2细胞线粒体膜电位的降低,ROS产生过量蓄积。与模型组比较,丹酚酸F组有效改善高糖诱导所致HK-2细胞的损伤(P<0.05),明显降低细胞培养基上清中LDH及IL-1β含量(P<0.05,P<0.01),显著减少PI阳性细胞的比例(P<0.01);丹酚酸F组降低Bax、Cyt C、Caspase-9、Caspase-3、GSDME蛋白表达,明显升高Bcl-2蛋白表达(P<0.05,P<0.01),HK-2细胞线粒体膜电位的升高,ROS的过量蓄积减少。结论:丹酚酸F通过减少ROS的产生,改善线粒体膜电位失衡,抑制Bax/Caspase-3/GSDME信号通路介导的细胞焦亡发挥改善高糖诱导所致HK-2细胞损伤的作用。

基于NLRP3/CASP1/GSDMD通路探讨益肾通络方抑制糖尿病肾脏疾病小鼠足细胞焦亡的作用机制

目的观察益肾通络方(熟地黄、黄芪、山萸肉、丹参、大黄、鬼箭羽、血竭)对db/db小鼠足细胞及小鼠肾足细胞MPC-5焦亡的影响,探讨其抑制糖尿病肾脏疾病足细胞焦亡改善足细胞损伤的可能作用机制。方法①体内实验。以db/db小鼠(模型组及各给药组)及同窝对照db/m小鼠(对照组)为研究对象。db/db小鼠按体质量随机分为5组,除模型组外,其余4组分别按照每日1.0、2.5、5.0 g/kg剂量给予益肾通络方及10 mg/kg缬沙坦灌胃,模型组及对照组给予等量蒸馏水。治疗8周后,透射电子显微镜观察小鼠肾脏组织中足细胞数量与形态变化情况;对肾脏组织进行TUNEL染色,同时利用免疫荧光技术标记足细胞标志蛋白Wilms瘤基因1(WT-1);酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测小鼠血清白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)水平;利用实时荧光定量PCR、Western blotting检测小鼠肾脏组织中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶-1(CASP1)、焦孔素D(GSDMD)mRNA及蛋白表达和激活情况。②体外实验。以糖基化终末期产物(AGEs)诱导的小鼠肾足细胞MPC-5为研究对象,利用CCK-8法及乳酸脱氢酶(LDH)释放检测技术,评价细胞成活率及细胞膜完整性;利用Q-PCR、Western blotting检测MPC-5细胞中NLRP3、CASP1、GSDMD的mRNA及蛋白表达和激活情况。结果①体内实验。与对照组相比,模型组小鼠肾脏足细胞足突出现融合,基底膜明显增厚,肾脏组织TUNEL染色阳性细胞比例增加,WT-1阳性表达率下降,血清中IL-1β、IL-18含量增加,NLRP3、CASP1、GSDMD、IL-1β及IL-18 mRNA表达上调,NLRP3蛋白表达上调,CASP1、GSDMD被激活(均P<0.05);与模型组相比,益肾通络方不同剂量干预后,肾脏组织的足细胞损伤情况缓解,肾脏组织TUNEL阳性细胞明显减少,血清中IL-1β、IL-18含量下降,NLRP3、CASP1、GSDMD mRNA表达下调,NLRP3蛋白表达下调,CASP1、GSDMD通路蛋白激活被抑制(均P<0.05)。②体外实验。与对照组相比,模型组MPC-5细胞活性下降,LDH释放增加,NLRP3、CASP1、GSDMD、IL-1β及IL-18 mRNA表达上调,NLRP3蛋白表达上调,CASP1、GSDMD被激活(均P<0.05);给予益肾通络方作用后,足细胞损伤情况改善,LDH释放率下降,NLRP3、CASP1、GSDMD mRNA表达下调,NLRP3蛋白表达下调,CASP1、GSDMD通路蛋白激活被抑制(均P<0.05)。结论益肾通络方可能通过抑制NLRP3/CASP1/GSDMD信号通路的激活,减少足细胞焦亡的发生,进而发挥改善糖尿病肾脏疾病小鼠足细胞损伤的作用。

基于网络药理学探讨益肾通络方治疗糖尿病肾脏疾病的药效作用机制及关键调控通路的验证

目的探讨益肾通络方治疗糖尿病肾脏疾病(DKD)的活性成分、作用靶点及可能的药效作用机制。方法利用中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)、中医药百科全书数据库(ETCM)和BATMAN-TCM数据库筛选得到益肾通络方的有效成分及相关作用靶点,通过文献检索对上述化学成分和作用靶点信息进行补充,进一步与GeneCards数据库、OMIM数据库、TTD数据库、DrugBank数据库中与DKD有关的靶点信息进行关联。基于String 11.0软件构建的蛋白相互作用(PPI)网络,得到与益肾通络方中主要活性成分相对应的关键靶点,运用cytoscape 3.8.0构建“成分-疾病-靶点”中药复方调控网络图,初步预测益肾通络方治疗DKD的药效作用机制。同时利用R语言BioConductor与pathview软件进行基因本体论(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,揭示相关靶基因和通路的功能。以高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞(SV40-MES-13)为主要研究对象,采用荧光素酶报告基因检测、实时荧光定量PCR、蛋白质印迹检测研究益肾通络方对关键靶基因表达及相关通路调控作用的影响,对其药效作用机制进行验证。结果筛选得到益肾通络方中108个具有潜在DKD治疗作用的活性成分及相对应的417个作用靶点。“成分-疾病-靶点”网络图提示山柰酚、黄芪甲苷等是益肾通络方中发挥DKD治疗作用的主要活性成分,蛋白激酶(Akt)、白细胞介素-6(IL-6)等是上述化学成分作用的关键靶点。GO功能注释及KEGG通路富集结果表明,筛选所得关键靶点主要涉及药物免疫反应、氧化应激反应、炎症反应、信号转导等一系列生物学反应过程,主要参与晚期糖基化终末产物及其受体(AGE-RAGE)、PI3K/Akt等信号通路的调控。实验结果表明,益肾通络方有效改善高糖诱导SV40-MES-13细胞中炎症相关指标TNF-α、IL-6以及纤维化相关指标TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ等的激活(P<0.05)。结论益肾通络方对DKD的治疗具有多成分、多靶点、多途径的特点,其可能通过调控AGE-RAGE、PI3K/Akt信号通路,抑制炎症反应及肾脏组织纤维化发挥治疗DKD的作用。